? ? ? ?如何確定新藥人體內(nèi)首次給藥（first in human，F(xiàn)IH）劑量是新藥研究過(guò)程中的重要環(huán)節(jié)之一，在臨床實(shí)驗(yàn)的過(guò)程中，F(xiàn)IH劑量代表著臨床實(shí)驗(yàn)的起點(diǎn)，因此必須絕對(duì)安全。在FDA的指導(dǎo)方案中，F(xiàn)IH可以通過(guò)在相關(guān)物種上進(jìn)行的多種藥理、毒理研究得出的，“未觀察到不良反應(yīng)水平”（No Observable Adverse Effect Level，NOAEL）確定，此概念一般認(rèn)為是臨床前藥理毒理實(shí)驗(yàn)中，在相關(guān)物種上確定的最大安全劑量。通過(guò)物種敏感度、特異性及人體適用性等相關(guān)因素可以確定NOAEL的人體等效劑量（human equivalent dose，HED），再加上特定的安全系數(shù)（safety factor）計(jì)算得出人體最大安全起始劑量（human maximum recommended safe starting dose，MRSD）。然而，能夠高度激活免疫系統(tǒng)的生物藥物，即使在低劑量下也可能會(huì)引起諸如細(xì)胞因子釋放綜合征、神經(jīng)系統(tǒng)毒性等強(qiáng)烈的副作用。
? ? ? ?在TGN1412，CD28超級(jí)激動(dòng)劑臨床實(shí)驗(yàn)Ⅰ期“慘案”過(guò)后，為了提高臨床實(shí)驗(yàn)的安全性，EMA和FDA在2007年發(fā)布了針對(duì)生物藥FIH確立的具體指導(dǎo)方針，其中強(qiáng)調(diào)了包括雙特異性抗體在內(nèi)的一系列藥物的FIH計(jì)算，應(yīng)該基于“最小預(yù)期生物效應(yīng)級(jí)別”（minimum anticipated biological effect level，MABEL），此概念認(rèn)為是在人體中可以被認(rèn)為有生物學(xué)效果的最小劑量。
? ? ? ?近日，來(lái)自杜克大學(xué)的學(xué)者在《Journal for Immunotherapy of Cancer》上發(fā)表的文章，詳細(xì)分享了通過(guò)MABEL方法計(jì)算他們?cè)O(shè)計(jì)的一種用于治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的EGFRvⅢ-CD3雙特異性抗體（EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv）MRSD的方法，同時(shí)驗(yàn)證了通過(guò)此方法計(jì)算得出的FIH劑量在人外周血CD3的理論受體占有率（Theoretical receptor occupancy），來(lái)確定這一FIH劑量的安全性。
? ? ? ?在本文中，MABEL的計(jì)算應(yīng)用了體外、體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)（PK/PD）的數(shù)據(jù)，包括：在人類與相關(guān)物種體內(nèi)靶細(xì)胞上的靶標(biāo)結(jié)合及受體占有率；人類與相關(guān)物種靶細(xì)胞上的濃度-反應(yīng)（concentration-response）曲線；相關(guān)物種體內(nèi)的劑量/暴露-反應(yīng)（dose/exposure-response）曲線等。
EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與血細(xì)胞的結(jié)合
? ? ? ?研究者使用了流式細(xì)胞法，分別檢測(cè)了EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv雙特異性抗體與人、比格犬、CD-1小鼠、食蟹猴、Sprague Dawley大鼠、新西蘭白兔和豬的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的結(jié)合能力，來(lái)評(píng)估EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv在細(xì)胞水平上與CD3ε的親和力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖1），EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv只與人的PBMC結(jié)合，與其他種類動(dòng)物的PBMC不結(jié)合。與人PBMC結(jié)合的EC20為150ng/mL。
圖1 流式細(xì)胞法檢測(cè)，在人及相關(guān)物種（食蟹猴、比格犬、小鼠、新西蘭白兔、大鼠）的PBMC中，EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv 只與人的PBMC結(jié)合，且EC20為150ng/mL
EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合
? ? ? ?使用流式細(xì)胞法，分別檢測(cè)了EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與野生型人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87-MG（不表達(dá)EGFRvⅢ）及U87-MG-EGFRvⅢ穩(wěn)轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞系（表達(dá)EGFRvⅢ）的結(jié)合，用以評(píng)估EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與EGFRvⅢ在細(xì)胞水平上的結(jié)合能力。結(jié)果如圖2，EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與U87-MG-EGFRvⅢ穩(wěn)轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞系結(jié)合的EC20 為10307 ng/mL，與野生型U87-MG細(xì)胞系基本無(wú)結(jié)合。
圖2流式細(xì)胞法檢測(cè)，EGFRvⅢ-CD3 bi-scFv與EGFRvⅢ高表達(dá)腫瘤細(xì)胞系結(jié)合的EC20 為10307 ng/mL
細(xì)胞因子釋放實(shí)驗(yàn)
? ? ? ?使用Luminex multiplex platform，分別在PBMC單獨(dú)存在、PBMC+ U87-MG-EGFRvⅢ細(xì)胞（EGFRvⅢ+）、PBMC+ U87-MG細(xì)胞（EGFRvⅢ-）條件下，對(duì)hEGFRvIII-CD3 bi-scFv介導(dǎo)的人PBMC細(xì)胞因子釋放進(jìn)行了檢測(cè)，使用PMA作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果顯示（圖3），hEGFRvIII-CD3 bi-scFv介導(dǎo)人CD3+的細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的釋放量具有腫瘤抗原依賴性和劑量依賴性，在無(wú)EGFRvⅢ抗原存在的情況下，EGFRvIII-CD3 bi-scFv無(wú)法誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放；在有EGFRvⅢ存在的情況下，EGFRvIII-CD3 bi-scFv誘導(dǎo)人PBMC細(xì)胞因子IFN-?、IL-6、MIP-1α、GM-CSF和TNFα釋放的EC20分別為42.3、12.5、14.7、27.6和16.5 ng/mL。
圖3 hEGFRvIII-CD3 bi-scFv介導(dǎo)的人PBMC細(xì)胞因子釋放呈抗原依賴效應(yīng)及劑量依賴效應(yīng)
T細(xì)胞激活和增殖實(shí)驗(yàn)
? ? ? ?將EGFRvIII-CD3 bi-scFv在存在腫瘤抗原（U87-MG-EGFRvⅢ）或不存在腫瘤抗原（U87-MG）的條件下與人PBMC共同孵育5天，分別通過(guò)檢測(cè)CD25+T細(xì)胞的表達(dá)量和CFSE標(biāo)記細(xì)胞的比例來(lái)評(píng)估EGFRvIII-CD3 bi-scFv激活T細(xì)胞及誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖的能力。結(jié)果顯示，EGFRvIII-CD3 bi-scFv介導(dǎo)的T細(xì)胞激活及T細(xì)胞增殖具有抗原特異性和劑量依賴效應(yīng)。在EGFRvⅢ存在的體系中，EGFRvIII-CD3 bi-scFv激活T細(xì)胞和介導(dǎo)T細(xì)胞增殖的EC20分別為1021ng/mL、70.2 ng/mL。
圖4 EGFRvIII-CD3 bi-scFv在EGFRvIII+體系中介導(dǎo)T細(xì)胞激活的EC20為1021ng/mL為，介導(dǎo)T細(xì)胞增殖的EC20為70.2 ng/mL
腫瘤細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)
? ? ? ?使用鉻釋放測(cè)定法，分別檢測(cè)了EGFRvIII-CD3 bi-scFv對(duì)U87-MG-EGFRvⅢ細(xì)胞和U87細(xì)胞的殺傷效果，效靶比為20:1。結(jié)果顯示，EGFRvIII-CD3 bi-scFv對(duì)U87-MG-EGFRvⅢ細(xì)胞的殺傷效果具有劑量依賴效應(yīng)，EC20為1.34 ng/mL；對(duì)U87野生型細(xì)胞幾乎無(wú)殺傷作用。
圖5 EGFRvIII-CD3 bi-scFv對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效果具有腫瘤抗原特異性
? ? ? ?以上全部體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果匯總?cè)绫?所示，按照每種體外實(shí)驗(yàn)的20%藥理活性濃度（20% of the maximal effective concentration，EC20），基于人平均血漿容積為3L、患者平均體重為70kg計(jì)算人體初始給藥劑量（MRSD）。本系列實(shí)驗(yàn)中，最低的EC20來(lái)自于腫瘤細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)（1.34 ng/mL），相當(dāng)于每位患者4020 ng或 57.4 ng/kg的起始劑量。
表1 體外實(shí)驗(yàn)測(cè)定的EC20值及對(duì)應(yīng)的HED值
小鼠體內(nèi)重復(fù)給藥、單次給藥毒性實(shí)驗(yàn)
? ? ? ?研究人員分別在NSG-人PBMC免疫重建小鼠模型和CD3人源化小鼠模型上進(jìn)行了體內(nèi)毒性實(shí)驗(yàn)。在移植了U87-MG-EGFRvⅢ膠質(zhì)瘤細(xì)胞和人PBMC的NSG免疫缺陷小鼠中，EGFRvIII-CD3 bi-scFv的給藥劑量為2.5 mg/kg，經(jīng)尾靜脈連續(xù)給藥5天，每日一次。結(jié)果顯示，給藥組的小鼠生存率較溶劑對(duì)照組有顯著性延長(zhǎng)（圖6，P=0.0079），證明EGFRvIII-CD3 bi-scFv在此模型上不具有毒性。
? ? ? ?在CD3人源化小鼠模型中，研究人員也測(cè)試了EGFRvIII-CD3 bi-scFv單次給藥10 mg/kg的劑量，同樣未觀察到顯著的毒性反應(yīng)（數(shù)據(jù)未給出）。此數(shù)據(jù)結(jié)合該實(shí)驗(yàn)室往次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在嚙齒動(dòng)物模型上，每日2.5 mg/kg的給藥劑量為安全有效劑量。
圖6 EGFRvIII-CD3 bi-scFv在U87-MG-EGFRvⅢ/PBMC-NSG鼠移植模型上可顯著提高小鼠生存率
體內(nèi)有效、安全劑量計(jì)算
? ? ? ?基于嚙齒類模型中每日2.5 mg/kg的安全有效給藥劑量，計(jì)算人體等效劑量。公式為
CLhu：預(yù)期人體清除率；Ceff,ss：預(yù)測(cè)穩(wěn)態(tài)下有效濃度；Tau：給藥間隔
? ? ? ?hEGFRvIII-CD3 bi-scFv的結(jié)構(gòu)與博納吐單抗（Blinatumomab，Blincyto，CD3-CD19雙特異性抗體，2014年美國(guó)上市）類似，博納吐單抗在成年人體內(nèi)的清楚速率為43 mL/h/kg，因此研究者選用這個(gè)數(shù)據(jù)作為CLhu的參考。Ceff,ss為在hCD3轉(zhuǎn)基因小鼠中以5 mg/kg劑量測(cè)得的PK數(shù)據(jù)（0.583 μg/mL）。給藥間隔Tau為24小時(shí)。
? ? ? ?根據(jù)此公式，計(jì)算出的人體等效劑量為0.6mg/kg，而由體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算得出的MABEL劑量為57.4ng/kg，較嚙齒類動(dòng)物模型上藥效數(shù)據(jù)計(jì)算出的劑量低10400倍。證實(shí)了此劑量（57.4ng/kg）在動(dòng)物模型上的安全性。
受體占有率計(jì)算
? ? ? ?靶抗原的理論占有率（receptor occupancy，RO）是藥物臨床起始劑量選擇的重要因素之一。TGN1412 FIH的選擇，0.1mg/kg的劑量換算得出的人體外周血中的RO約為90%，對(duì)于激動(dòng)劑而言可能過(guò)高。在本文中，研究人員根據(jù)兩個(gè)不同的公式評(píng)估了基于MABEL方法計(jì)算得出的hEGFRvIII-CD3 bi-scFv給藥劑量（57.4ng/kg）在人體中的理論受體占有率，如下所示：
? ? ? ?公式1：
? ? ? ?公式1基于米氏方程（Michaelis-Menten equilibrium），其中RO為受體占有率，Ab為抗體起始濃度（引用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)EC20，1.34 ng/mL或26.3pM），KD為藥物對(duì)應(yīng)抗原的平衡解離常數(shù)。
? ? ? ?公式2：
? ? ? ?公式2為公式1的升級(jí)版，由于在已知體系中存在大量靶受體的情況下，由米氏方程計(jì)算出的RO可能不準(zhǔn)確，因此選用公式2進(jìn)行RO的計(jì)算。其中RO為受體占有率，KD為藥物對(duì)應(yīng)抗原的平衡解離常數(shù)，TD為總藥物濃度（對(duì)應(yīng)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)EC20，1.34 ng/mL或26.3pM），TT為總目標(biāo)濃度。
? ? ? ?TT的計(jì)算方法為：
? ? ? ?其中n1為每個(gè)細(xì)胞上CD3受體的數(shù)目（6.11×104），n2為每體積中T細(xì)胞的數(shù)目（1.3×109 L?1），NA為阿伏伽德羅常數(shù)。
? ? ? ?由公式2計(jì)算得出的MABEL劑量的理論受體占有率（引用與CD3ε結(jié)合的KD和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的EC20）為0.17%。對(duì)于激動(dòng)劑而言，根據(jù)已知藥理學(xué)和臨床前實(shí)驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)，可接受的RO數(shù)據(jù)上限約為10%，本研究中基于MABEL劑量計(jì)算得出的RO的數(shù)據(jù)遠(yuǎn)低于這一限度。但研究人員也說(shuō)明了這種方法的限制性，由于hEGFRvIII-CD3 bi-scFv為雙特異性抗體，該方法無(wú)法計(jì)算藥物同時(shí)與表達(dá)于不同細(xì)胞上的靶抗原（EGFRvIII于腫瘤細(xì)胞，CD3于T細(xì)胞）結(jié)合的理論受體占有率。
? ? ? ?本文詳細(xì)地介紹了一種激動(dòng)劑型雙特異性抗體基于MABEL方法計(jì)算FIH的過(guò)程及實(shí)驗(yàn)思路，通過(guò)對(duì)比MABEL劑量與臨床前體內(nèi)等效劑量，確定了這種方法的安全性，對(duì)于激動(dòng)型抗體藥物的FIH計(jì)算具有一定的參考價(jià)值。
? ? ? ?原創(chuàng)內(nèi)容未經(jīng)授權(quán)，禁止轉(zhuǎn)載至其他平臺(tái)。
參考文獻(xiàn)
Schaller, Teilo H., et al. "First in human dose calculation of a single-chain bispecific antibody targeting glioma using the MABEL approach." Journal for Immunotherapy of Cancer 8.1 (2020).
