? ? ? ?PD-1及CTLA-4等免疫檢查點(diǎn)近些年來(lái)在抗腫瘤治療中進(jìn)展火熱，但是在單一免疫檢查點(diǎn)療法中往往僅有10%到30%左右的病人病情能夠得到有效緩解，其耐藥機(jī)制仍是目前需要仔細(xì)探索的。為了突破這一瓶頸，以PD-1單抗為代表的相關(guān)免疫治療常常會(huì)與其他免疫檢查點(diǎn)抗體藥物聯(lián)用以求取得更顯著的治療效果。LAG3（Lymphocyte activation gene-3）是一種免疫檢查點(diǎn)受體蛋白，主要表達(dá)在活化的T細(xì)胞、NK細(xì)胞、B細(xì)胞、漿細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞，有研究表明在一些小鼠腫瘤模型的瘤內(nèi)T細(xì)胞中其PD-1表達(dá)的同時(shí)也高表達(dá)LAG3，而這類抑制分子常在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）和耗竭的CD8+ T細(xì)胞上共表達(dá)，從而一定程度的抑制免疫反應(yīng)的發(fā)生[1]。故與單一療法相比，LAG3與PD-1雙靶點(diǎn)共抑制可以有效增強(qiáng)CD4+及CD8+T 細(xì)胞的浸潤(rùn)能力，T細(xì)胞其他功能也有所提高，這些顯著的成果使得將二者聯(lián)用的治療方法在臨床研究中成為又一熱點(diǎn)。 ? ? ? ?LAG3與CD4在結(jié)構(gòu)上類似，含有4個(gè)胞外免疫球蛋白超家族類似結(jié)構(gòu)域，這些胞外域是與配體結(jié)合是傳達(dá)T細(xì)胞抑制信號(hào)所必需的。金屬蛋白酶ADAM10/17（a disintegrin and metalloproteionase domain-containing protein 10/17）可以裂解LAG3，使其胞外端脫落形成一種單體可溶性的LAG3（sLAG3）。有研究表明，如果使得LAG3不被ADAM10/17裂解，T細(xì)胞在體外的活性被明顯抑制從而影響其在增殖及細(xì)胞因子分泌等的功能削弱[2]，但LAG3的脫落在體內(nèi)對(duì)免疫相關(guān)治療的影響尚不明確。
? ? ? ?為了研究這一問(wèn)題，美國(guó)匹茲堡大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Lawrence P. Andrews團(tuán)隊(duì)建立了一種T細(xì)胞表達(dá)不可裂解形式LAG3（LAG3NC）的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，在該模型上他們進(jìn)行了一系列關(guān)于LAG3脫落對(duì)抗腫瘤效果影響的實(shí)驗(yàn)并于近日發(fā)表在了Science Immunology上，該文章揭示了LAG3的脫落在LAG3抑制信號(hào)通路中的重要地位，這對(duì)免疫療法的發(fā)展有積極作用。
? ? ? ?為了評(píng)估T細(xì)胞上LAG3脫落對(duì)免疫反應(yīng)的影響，Lawrence P. Andrews團(tuán)隊(duì)選用了Cre-loxP重組酶系統(tǒng)來(lái)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠模型。對(duì)LAG3序列在位于胞外結(jié)構(gòu)域D4與跨膜蛋白結(jié)構(gòu)域之間的Lag3 exon 7中特定區(qū)域兩端插入LoxP位點(diǎn)，再將表達(dá)該LAG3突變的Lag3NC.L/L小鼠與攜帶不同Cre重組酶的小鼠雜交，從而建立出在特定細(xì)胞類型上表達(dá)LAG3NC的小鼠來(lái)探究不同種類T細(xì)胞對(duì)LAG3脫落的反應(yīng)，最終得到Lag3NC.L/LCD4Cre（全部T細(xì)胞表達(dá)LAG3NC）、Lag3NC.L/LE8ICre.GFP（僅CD8+細(xì)胞表達(dá)）、Lag3NC.L/LThPOKCreERT2（僅CD4+細(xì)胞表達(dá)）及Lag3NC.L/LFoxp3CreERT2.GFP（僅Tregs細(xì)胞表達(dá)）這四種類型的小鼠。
? ? ? ?研究人員分別在Lag3NC.L/L和Lag3NC.L/LCD4Cre兩種不同小鼠品系上接種MC38及B16-F10腫瘤細(xì)胞，他們發(fā)現(xiàn)兩個(gè)品系小鼠體內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)情況并無(wú)顯著不同，CD4+細(xì)胞及CD8+細(xì)胞的增殖死亡情況等也并無(wú)差異。隨后，他們使用這兩種小鼠品系進(jìn)行PD-1抗體的免疫治療研究，有趣的現(xiàn)象發(fā)生了，Lag3NC.L/LCD4Cre小鼠對(duì)PD-1抗體的敏感性顯著降低，腫瘤清除的效果不如Lag3NC.L/L小鼠。為驗(yàn)證該結(jié)論不僅局限與該腫瘤模型，Lawrence等人在這些小鼠體內(nèi)建立了另外兩種不同的腫瘤模型：（1）在小鼠首次皮下接種MC38第12天切除腫瘤組織，一個(gè)月后再次接種MC38細(xì)胞評(píng)估兩種小鼠對(duì)腫瘤清除能力；（2）小鼠接種過(guò)表達(dá)gp100的B16腫瘤細(xì)胞后，選用抗PD-1藥物和Amph-vax/Amph-E7聯(lián)合給藥評(píng)估藥物的抑瘤效果。結(jié)果顯示，Lag3NC.L/LCD4Cre小鼠的抗腫瘤效果明顯較弱（圖1），這些現(xiàn)象均能證明T細(xì)胞上LAG3NC的表達(dá)能夠影響腫瘤的清除。
圖1. LAG3NC抑制體內(nèi)的抗腫瘤作用
? ? ? ?為了進(jìn)一步確定LAG3的脫落是否影響CD4+T細(xì)胞群體的功能，研究人員選用上文所提到的幾種不同的小鼠品系建立腫瘤模型并對(duì)腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)細(xì)胞（TILs）功能性進(jìn)行了檢測(cè)，LAG3胞外段的不可裂解并沒(méi)有對(duì)CD8+T細(xì)胞或Tregs細(xì)胞造成較為明顯的影響，反而是常規(guī)CD4+T細(xì)胞（Tconv細(xì)胞）的功能性（如IFN-γ，TNF-α和IL-2等細(xì)胞因子的分泌）和增殖受到了抑制（圖2）。除此之外，實(shí)驗(yàn)性自身免疫腦脊髓炎（簡(jiǎn)稱EAE，一種CD4+T 細(xì)胞介導(dǎo)為主的自身免疫性疾?。┮沧鳛榱艘环N有效模型來(lái)評(píng)估LAG3NC對(duì)T細(xì)胞的影響，Lag3NC.L/LCD4Cre小鼠的EAE嚴(yán)重程度與Lag3NC.L/LE8ICre.GFP小鼠/Lag3NC.L/L小鼠相比明顯較弱。這些數(shù)據(jù)表明了受LAG3NC調(diào)控的Tconv細(xì)胞在腫瘤免疫中有著重要的地位，LAG3NC本質(zhì)影響的是Tconv細(xì)胞。 圖2. LAG3NC影響T細(xì)胞功能
? ? ? ?那么CD8+T細(xì)胞呢？LAG3的脫落是否也會(huì)影響其功能呢？答案是肯定的，但這種影響并不是內(nèi)在的，而是外在的。研究人員在Lag3NC.L/LE8ICre.GFP小鼠及Lag3NC.L/L小鼠上建立了腫瘤模型并對(duì)比了它們對(duì)PD-1單抗的敏感性，結(jié)果顯示二者之間并沒(méi)有明顯的藥效差異。同時(shí)，他們還對(duì)CD8+TILs的功能性進(jìn)行了分析，從Lag3NC.L/LCD4Cre小鼠分離出的TILs在經(jīng)過(guò)PD-1抗體治療后其CD8+T細(xì)胞的TNF-α及IFN-γ釋放能力明顯減弱，而Lag3NC.L/LE8ICre.GFP小鼠體內(nèi)的CD8+ TILs功能性卻與對(duì)照組沒(méi)有大的差異（圖3），這一結(jié)果揭示了一個(gè)現(xiàn)象：CD8+ T細(xì)胞功能的改變或許并不是通過(guò)其細(xì)胞本身的LAG3變化，而是通過(guò)Tconv細(xì)胞上的LAG3脫落所間接影響的。
圖3. LAG3NC并非本質(zhì)影響CD8+T細(xì)胞功能
? ? ? ?作者的一系列實(shí)驗(yàn)證明了在小鼠體內(nèi)，受到LAG3裂解本質(zhì)上影響的是Tconv細(xì)胞而非CD8+T細(xì)胞或Treg細(xì)胞，進(jìn)而使得T細(xì)胞相關(guān)的免疫反應(yīng)受到限制，那么這一結(jié)論在臨床上是否也依然站得住腳呢？為了解決這一問(wèn)題，研究人員針對(duì)LAG3與ADAM10的表達(dá)之間的關(guān)系進(jìn)行了研究。通過(guò)對(duì)來(lái)自首次治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤病人的新鮮腫瘤組織及外周血淋巴細(xì)胞（PBLs）進(jìn)行分析，他們發(fā)現(xiàn)與健康人的外周血淋巴細(xì)胞相比，患病者的PBLs有更多的LAG3和ADAM10表達(dá)，但二者之間的關(guān)系往往呈負(fù)相關(guān)性。為進(jìn)一步確定這一規(guī)律的可靠性，他們又獲取了一些已經(jīng)接受了免疫治療的晚期轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者及其他皮膚癌患者的樣本（包含對(duì)免疫治療有響應(yīng)與無(wú)響應(yīng)的）進(jìn)行同樣地分析，其中無(wú)應(yīng)答者的Tconv細(xì)胞LAG3表達(dá)明顯升高但ADAM10的表達(dá)減弱。這表明Tconv細(xì)胞上LAG3：ADAM10表達(dá)比例的高低可以一定程度的幫助判斷PD-1等免疫療法的成功與否。
? ? ? ?雖然這篇文章告知了我們Tconv細(xì)胞上LAG3表達(dá)對(duì)免疫療法的重要性，但與Tconv細(xì)胞相比，耗竭的CD8+T 細(xì)胞與Tregs表面的LAG3始終保持著高水平的表達(dá)[3]，難道ADAM10這些金屬蛋白酶就不能使得它們表面的LAG3脫落嗎？如果能，這些細(xì)胞上LAG3的脫落也能夠重振免疫反應(yīng)嗎？怎么做能夠輔助這些LAG3的脫落？這些問(wèn)題的答案尚不得知，LAG3脫落對(duì)T細(xì)胞的抑制作用的解除機(jī)制仍需進(jìn)一步研究探索。目前已有多個(gè)免疫相關(guān)的臨床研究選擇與LAG3靶點(diǎn)藥物聯(lián)合治療，所以對(duì)LAG3抑制信號(hào)通路的理解顯得尤為重要，Lawrence P. Andrews團(tuán)隊(duì)對(duì)LAG3脫落機(jī)制的發(fā)現(xiàn)為其相關(guān)的免疫研究提供了新的思路。相信在不久的將來(lái)隨著人們對(duì)免疫檢查點(diǎn)的深入研究，目前所面臨的難關(guān)必能順利地逐一突破。
Reference：
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