? ? ?? 來源：生物制品圈

? ? ?? 抗體藥物包括單克隆抗體藥物，抗腫瘤單抗偶聯(lián)物，雙特異性抗體，抗體片段等等。這些藥物的靶點主要是細(xì)胞表面與疾病相關(guān)的抗原或特定的受體分子?？贵w進(jìn)入人體之后，首先與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合，再通過一系列的生物學(xué)作用，如偶聯(lián)放射性核素的殺傷作用、阻斷細(xì)胞因子的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、引起補(bǔ)體的級聯(lián)激活等，進(jìn)而發(fā)揮抗體的治療作用。
? ? ?? 在抗體藥物的臨床前研發(fā)中，一旦確定抗體藥物的分子形式并在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)出抗體蛋白分子后，就需要對抗體的活性進(jìn)行驗證與測定。活性測定是對藥物的有效成分和含量以及藥物效價的測定，是確?？贵w類藥物有效性的重要質(zhì)控指標(biāo)。目前研發(fā)生產(chǎn)中主要通過測定抗體的抗原結(jié)合能力來評價活性，常用的方法有ELISA法；流式細(xì)胞儀法；一些新技術(shù)測定法如SPR技術(shù)，目前應(yīng)用較為廣泛的是GE醫(yī)療生命科學(xué)的Biacore。另外還可以模擬抗體的作用機(jī)制，測定其體外生物學(xué)活性并進(jìn)行評價。
一、抗原結(jié)合能力測定

1. ELISA法
? ? ?? 用ELISA法測定抗體的抗原結(jié)合能力一般需要具備相應(yīng)的可溶性抗原。將可溶性抗原包被于96孔板中，待測抗體與標(biāo)準(zhǔn)品作系列稀釋，并分別與酶標(biāo)抗體混合后加入96孔板，待測抗體與標(biāo)準(zhǔn)品將與酶標(biāo)抗體競爭結(jié)合包被抗原，孵育一段時間后洗脫未結(jié)合的抗體，隨著待測抗體濃度的降低，酶標(biāo)抗體與包被抗原的結(jié)合量逐漸增加，檢測的吸收值逐漸增高，并與待測抗體的濃度呈負(fù)相關(guān)性。對待測抗體濃度、吸光值作四參數(shù)擬合，可得到反“S”形曲線，以曲線的IC50 值評價抗體的抗原結(jié)合能力。ELISA方法操作比較簡單、耐用性好，為避免標(biāo)記抗體活性或其他試驗因素對測定結(jié)果的影響，必須有標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行平行操作。
2. 流式細(xì)胞儀法
? ? ?? 流式細(xì)胞儀測定與ELISA法測定原理基本相同，不同的是將可溶性抗原變?yōu)榧?xì)胞，并通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的陽性率指標(biāo)來檢測待測抗體與標(biāo)記抗體的競爭結(jié)合情況。該方法的優(yōu)點是選用攜帶抗原的細(xì)胞進(jìn)行檢測，細(xì)胞表面的抗原空間結(jié)構(gòu)更接近體內(nèi)存在形式，使待測結(jié)果更接近實際情況，另外該方法還避免了相應(yīng)抗原的制備純化過程，對于不易獲得可溶性抗原的抗體可采用該方法進(jìn)行測定（圖1）。

圖1 流式細(xì)胞儀測定抗體的抗原結(jié)合能力

3. 新技術(shù)測定法
? ? ?? 基于新技術(shù)的生物學(xué)活性測定方法主要有表面等離子共振效價測定法（SPR）、均相時間分辨熒光、 Alpha 技術(shù)、熒光染料標(biāo)記法等，這里我們主要介紹一下SPR法在蛋白活性測定過程中的應(yīng)用。
? ? ?? 表面等離子共振技術(shù)（Surface Plasmon Resonance，SPR）是一種用于生物分子間相互作用分析的新技術(shù)，已經(jīng)成為抗體領(lǐng)域分子互作的“金標(biāo)準(zhǔn)”并被FDA收錄。
? ? ?? 目前在基礎(chǔ)科研和制藥行業(yè)被廣泛應(yīng)用的儀器是GE醫(yī)療生命科學(xué)的Biacore。它可以應(yīng)用于抗體候選物的篩選與評價；抗體與抗原結(jié)合活性的分析；抗體與受體結(jié)合活性的分析；抗體活性濃度分析；安全性評價中的免疫原性分析；生物類似藥一致性分析以及抗體生產(chǎn)質(zhì)控與批次放行等。
? ? ?? SPR具體測定過程如下：將抗體固定于芯片表面，待測抗原通過微流控系統(tǒng)流經(jīng)其上，抗原抗體一旦結(jié)合，芯片表面的物質(zhì)質(zhì)量濃度就會增加，進(jìn)而引起芯片表面液體折射率的變化而被檢測到。該技術(shù)測定抗原抗體結(jié)合活性時不需要標(biāo)記，避免了標(biāo)記對分子結(jié)構(gòu)的影響，能更加真實地反映抗原抗體的結(jié)合情況。它測定周期短，樣品用量少，一般僅有微克級，可用于微量樣品的測定。同時使用親和力信息及動力學(xué)信息來闡述分子間結(jié)合機(jī)理（圖2）。

圖2? SPR技術(shù)作用原理

1) 抗體與抗原結(jié)合活性的分析，抗體候選物的篩選與評價
? ? ?? GE醫(yī)療生命科學(xué)的Easy Biacore是基于SPR技術(shù)，利用捕獲法檢測抗原抗體之間的相互作用。它主要利用捕獲分子與配體之間高親和的特性，從而實現(xiàn)對配體定向捕獲（圖3）。該方法操作簡便，檢測速度快；雜交瘤細(xì)胞上清等粗樣品可直接上樣，無需純化；芯片可再生后反復(fù)使用、運行成本低。羅氏診斷對診斷抗體的篩選也是利用了Biacore的“捕獲法”：兔子腹水直接上樣，一次性完成130個單抗的篩選，并結(jié)合Biacore強(qiáng)大的功能做Ranking得到了最好的Top5目的抗體。

圖3 Biacore捕獲法檢測抗原抗體之間相互作用

2) 抗體與受體結(jié)合活性的分析，如抗體與FcγRllla、FcγRlllb 等受體結(jié)合的親和力、動力學(xué)信息
? ? ?? 2019 年 2 月， 首個國產(chǎn)生物類似藥漢利康正式獲批上市, 開啟了中國生物類似藥新時代。在生物類似藥的分析相似性評價中，關(guān)鍵一環(huán)就是說明藥物的結(jié)合活性與原研藥相似度，從而確定me too or me better。復(fù)宏漢霖漢利康?（HLX01）的抗體免疫特性的檢測，是基于GE生命科學(xué)的 Biacore 完成的。
? ? ?? 在抗體-FcγR 受體結(jié)合活性分析中，使用 Biacore T200 分別檢測了不同抗體與FcγRIa，F(xiàn)cγRIIa，F(xiàn)cγRIIb/c，F(xiàn)cγRIIIa-F，F(xiàn)cγRIIIa-V ，F(xiàn)cγRIIIb 和 FcRn 的結(jié)合。Fc 受體結(jié)合分析測試的結(jié)果顯示，HLX01 與 CN-Rituximab 和 EU-Rituxima 結(jié)果高度相似（圖4）。

圖4 HLX01 與 CN-Rituximab 和 EU-Rituxima 相似性結(jié)果

3) 抗體活性濃度分析， 包括基于標(biāo)準(zhǔn)品的活性成分濃度分析和無需依賴標(biāo)準(zhǔn)品的活性成分濃度分析方法
? ? ?? 目前，GE醫(yī)療生命科學(xué)的Biacore基于SPR的無標(biāo)曲檢測法（CFCA calibration-free concentration analysis）可用于蛋白樣品的有效活性濃度檢測，這種方法直接檢測有效互作的分子，無需進(jìn)行復(fù)雜的樣品處理和方法建立。結(jié)果可靠，簡單和精準(zhǔn)，或可成為活性蛋白濃度檢測基準(zhǔn)方法。
? ? ?? Biacore檢測是將配體固定在芯片表面，分析物流經(jīng)芯片表面。在這個過程中，分析物的濃度受到物質(zhì)遷移速率的影響。CFCA檢測可通過分析物以兩種流速流經(jīng)芯片表面，通過物質(zhì)遷移速率的計算，儀器自動擬合出分析物的濃度（圖5）。

圖5 分析物在流路管路中由溶液向芯片表面垂直擴(kuò)散

二、生物學(xué)活性測定

1. 補(bǔ)體依賴細(xì)胞毒（complement-dependent cytotoxicity，CDC）作用
? ? ?? 有些抗腫瘤抗體的作用途徑之一是通過補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒作用。CDC作用機(jī)制如下：抗體先與細(xì)胞表面抗原結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物，抗體Fc 片段的補(bǔ)體結(jié)合位點暴露并與補(bǔ)體C1結(jié)合,進(jìn)而通過后續(xù)的補(bǔ)體級聯(lián)激活途徑完成攻膜復(fù)合物的裝，在細(xì)胞表面打孔，最終導(dǎo)致溶細(xì)胞效應(yīng)。
? ? ?? 體外測定抗體CDC 作用的過程基本是模擬其體內(nèi)作用方式。選擇具有相應(yīng)抗原的細(xì)胞鋪板，加入不同稀釋度的抗體孵育，使抗體與細(xì)胞表面抗原充分結(jié)合，然后再加入補(bǔ)體孵育，結(jié)合于細(xì)胞表面的抗體將補(bǔ)體成分激活，進(jìn)而將細(xì)胞殺死。由于抗體濃度不同，細(xì)胞的殺傷率也不同，對體濃度及吸光度進(jìn)行四參數(shù)曲線擬合可得到反S 形曲線，以其EC 值作為評價抗體CDC 活性的指標(biāo)。

2. 殺傷活性中和試驗
? ? ?? 有些細(xì)胞因子與其受體結(jié)合后能產(chǎn)生細(xì)胞殺傷活性，針對該細(xì)胞因子的抗體能阻斷其與受體的結(jié)合，對其殺傷活性其有中和效應(yīng)。例如，腫瘤壞死因子-α（TNF-α）能與胞表面受體結(jié)合并對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。因此人們研制出針對TNF-α的抗體用于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的治療。該抗體即可通過殺傷活性中和試驗來評價。選擇一種對殺傷作用敏感的細(xì)胞株， 培養(yǎng)至合適密度后加入96 孔板；用一定濃度TNF-α 溶液將待測抗體及標(biāo)準(zhǔn)品作梯度稀釋，然后將各稀釋度的抗體溶液加入含有細(xì)胞的孔板中孵育， 抗體與TNF-α結(jié)合后斷了其與細(xì)胞表面受體的結(jié)合· 中和了其細(xì)殺傷活性，因此抗體濃度越高，中和作用越強(qiáng)，細(xì)胞的生存率也越高；對活細(xì)染色后定OD值，對抗體濃度進(jìn)行四參數(shù)擬合，以EC50值作為評價抗體活性的指標(biāo)。

3. 細(xì)胞增殖抑制試驗
? ? ?? 增殖抑制試驗的原理與殺傷抑制試驗相似，同樣是通過阻斷細(xì)胞因子對細(xì)胞的作用來反映抗體的活性。該方法中細(xì)胞的生長對細(xì)胞因子具有依賴作用，當(dāng)細(xì)胞因子與待測抗體結(jié)合后， 無法與細(xì)胞表面受體結(jié)合，細(xì)胞在得不到增殖刺激的情況下死亡?？贵w濃度越高，增殖抑制作用越強(qiáng)，細(xì)胞死亡率越高，繼而擬合得到相應(yīng)的四參數(shù)曲線。

4. 熒光素酶報告基因法測定中和活性
? ? ?? 由于有些細(xì)胞因子與細(xì)胞表面受體結(jié)合后的信號傳導(dǎo)通路已經(jīng)比較了解，可以在細(xì)胞中插入熒光素酶報告基因，如果細(xì)胞因子與其受體結(jié)合，將引起熒光素酶的表達(dá)，通過加入底物顯色可以對結(jié)合情況進(jìn)行評價。針對這些細(xì)胞因子的單抗可通過熒光素酶報告基因法定中和活性，如針對IL-1β 的卡那奴單抗（canakinumab),測定原理如下：將帶有熒光素酶報告基因的鋪板，加入梯度稀釋的待測單抗及參比品，再加入IL-1β，IL-1β能刺激細(xì)胞引起熒光素酶的表達(dá)，但抗體與IL-1β 結(jié)合能中和其作用。隨著抗體濃度的增加， 熒光素酶表達(dá)量減少， 兩者呈負(fù)相關(guān)性， 最后加入底物顯色并檢測，通過平行線分析法計算待測單抗的活性。
? ? ?? 分子生物學(xué)的快速發(fā)展和細(xì)胞信號通路的深入研究促進(jìn)了基于細(xì)胞的生物活性測定方法的發(fā)展。越來越多的新型技術(shù)用于單抗藥物的活性檢測，可以實現(xiàn)對抗體藥物進(jìn)行精準(zhǔn)、多方位、動態(tài)的分析，為抗體藥物的質(zhì)量提供了新的保障。

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