? ? ?? 來(lái)源：生物制品圈 ?

? ? ?? 摘要

? 基于PD1/PD-L1的治療給腫瘤治療帶來(lái)了革命性的改變，截止2018年底，超過(guò)100多種anti-PD1 和 anti-PDL1 處在研發(fā)的不同階段，超過(guò)2000多個(gè)臨床研究試驗(yàn)注冊(cè)?？贵w的特性需要通過(guò)生物學(xué)檢測(cè)方法判定其生物學(xué)活性。在本文中，我們開發(fā)了一種基于細(xì)胞的生物學(xué)檢測(cè)方式用來(lái)評(píng)估anti-PD1 和 anti-PDL1 抗體的生物學(xué)活性。我們選擇了包含兩個(gè)細(xì)胞系的受體報(bào)告系統(tǒng)，比較了超抗原，可溶性Anti-CD3抗體，膜型Anti-CD3抗體，嵌合抗原受體（CARs）,雙特異性T細(xì)胞招募抗體對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的激活。我們對(duì)該生物測(cè)定方法進(jìn)行了表征，并證明其可用于分析anti-PD1和anti-PDL1的活性。所提出的生物測(cè)定方法可用于開發(fā)新的治療藥物及其表征方法。

程序性死亡受體1（PD1）主要表達(dá)于激活的T細(xì)胞表面。PD-1⁺淋巴細(xì)胞?與攜帶PD-1天然配體(PD-L1 或 PD-L2)?的抑制性淋巴細(xì)胞結(jié)合后，將抑制PD-1⁺淋巴細(xì)胞的活性。PD1與其配體形成復(fù)合物導(dǎo)致了T細(xì)胞CD3依賴性激活被阻斷。盡管與PD1相互作用的精確序列仍然不清楚，但是與PD1相互作用的蛋白質(zhì)，以及受這種相互作用影響的信號(hào)級(jí)聯(lián)已被確定。免疫反應(yīng)的抑制，保護(hù)機(jī)體不受T淋巴細(xì)胞過(guò)度活化和自體免疫反應(yīng)的影響，但同時(shí)也抑制了機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。

?抑制PD1與PDL1的相互作用，而不是與PDL2相互作用，可以消除負(fù)性免疫調(diào)節(jié)，是治療某些類型腫瘤最成功的策略之一。2018年，T.Honjo由于在免疫負(fù)性調(diào)節(jié)研究中的突出貢獻(xiàn)，獲得了諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。第一款PD-1和PD-L1抗體藥物分別在2014年和2016年上市。截止2018年年底，有關(guān)PD1/PD-L1抑制劑的臨床試驗(yàn)高達(dá)2000多項(xiàng)。

?治療制劑的表征需要開發(fā)用于檢測(cè)其生物活性的合理方法。理想情況下，生物學(xué)分析方法應(yīng)當(dāng)反映生物制劑的作用機(jī)制，實(shí)現(xiàn)定量比較生物制劑的不同。目前所使用的方法要么受到專利的限制，要么是基于人體原代細(xì)胞，這使得它們使用不方便，結(jié)果再現(xiàn)性差。我們的目的實(shí)構(gòu)建一種用于檢測(cè)anti-PD1 和antiPDL1抗體的生物學(xué)檢測(cè)方法，免于專利和原代細(xì)胞使用的種種限制。

? ? ?? 材料與方法

?材料

?DMEM/F12和RPMI1640培養(yǎng)基(PanEco, Russia)?，滅活的胎牛血清(Gibco,
USA)?，經(jīng)典單克隆抗體抗人PD1 (aPD1)?，抗人PDL1 (aPDL1)?抗人CTLA4抗體，（aCTLA4） ,抗人HER2(aHER2)?,抗人CD3和腫瘤相關(guān)抗原1的雙特異性抗體(aCD3/aTAA1)?，以及抗人CD3和腫瘤相關(guān)抗原2的雙特異性抗體(aCD3/aTAA2) (BIOCAD,Russia)?鼠抗人CD3單克隆抗體，克隆號(hào)HIT3a(BD, USA)?;ONEGlo luciferase Assay System (Promega, USA)?和葡萄球菌腸毒素B(SEB)(Toxin Technology, USA)?.

?細(xì)胞系?

Jurkat和Raji培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640；CHO-K1培養(yǎng)于含有10%FBS的DMEM/F12 。培養(yǎng)條件，37℃，5%CO2。所有細(xì)胞系用于基因工程化細(xì)胞株構(gòu)建，所有細(xì)胞系均經(jīng)過(guò)試劑盒以及PCR法檢測(cè)支原體污染。VenorTM GeM Mycoplasma Detection Kit, PCRbased (Sigma Aldrich, USA).

?載體構(gòu)建

?基于pOGI載體(BIOCAD)?構(gòu)建pOGI-NFATFLuc 質(zhì)粒；該載體包含螢火蟲熒光素酶，受IL2啟動(dòng)子控制，該啟動(dòng)子中含有3個(gè)重復(fù)的NF-AT（激活的T細(xì)胞核因子）結(jié)合序列，該載體中還含有潮霉素抗性基因。

?基于pSX?載體(BIOCAD)，構(gòu)建了pSX-tmaCD3, pSX-PD1,和 pSX-PDL1?質(zhì)粒。pSX-tmaCD3質(zhì)粒包含抗人CD3抗體OKT3?單鏈可變區(qū)片段scFv,融合了血小板生長(zhǎng)因子受體跨膜區(qū)，融合基因受CMV啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，該載體也包含了嘌呤霉素抗性基因。pSX-PD1在多克隆位點(diǎn)插入了人PD-1基因，受CMV啟動(dòng)子控制。該載體包含新霉素抗性基因。pSX-PDL1?包含了人PD-L1基因，受CMV啟動(dòng)子控制，該載體還包含新霉素抗性基因。

?穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建

?Jurkat NFAT FLuc?細(xì)胞系通過(guò)將pOGI-NFATFLuc?載體電轉(zhuǎn)化Jurkat細(xì)胞制備，在含有潮霉素B的培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選穩(wěn)定細(xì)胞株。并通過(guò)加入aCD3?，篩選在aCD3?存在時(shí)，報(bào)告基因最高表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。

?Jurkat NFAT FLuc PD1?細(xì)胞系通過(guò)將pSX-PD1 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進(jìn)Jurkat NFAT FLuc?細(xì)胞制備，在含有新霉素的培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，并通過(guò)流式細(xì)胞篩選表面高表達(dá)PD-1的細(xì)胞株。

?Raji PD-L1 細(xì)胞系通過(guò)將pSX-PDL1?質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化進(jìn)Raji細(xì)胞，在含有新霉素的培養(yǎng)基中篩選，并通過(guò)流式細(xì)胞篩選高表達(dá)PD-L1的細(xì)胞系。

?Jurkat NFAT-FLuc PD1 CAR?細(xì)胞系來(lái)源于慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)Jurkat NFATFLuc PD1細(xì)胞系，該慢病毒編碼一個(gè)嵌合抗原受體(CAR),該CAR通過(guò)T2A多肽鏈接子連接GFP熒光蛋白融合表達(dá)(BIO-CAD)。轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞系通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)篩選GFP陽(yáng)性細(xì)胞，最終得到Jurkat NFAT-FLuc PD1 CAR細(xì)胞系。

?CHO PDL1 tmaCD3細(xì)胞系通過(guò)質(zhì)粒pSX-PDL1 和pSX-tmaCD3轉(zhuǎn)染CHO-K1細(xì)胞，在含有新霉素/嘌呤霉素的培養(yǎng)基中得到篩選，最后通過(guò)流式篩選細(xì)胞表面高表達(dá)PD-L1和表達(dá)跨膜型CD3抗體aCD3 (tmaCD3)的細(xì)胞系，PD-L1通過(guò)PD-L1抗體檢測(cè)，aCD3通過(guò)FC檢測(cè)。

?生物學(xué)功能檢測(cè)

?在白色96孔板上進(jìn)行發(fā)光分析(SPL Life Sciences, Korea Republic). 除非另有說(shuō)明，細(xì)胞懸液中含有50，000 Jurkat NFAT FLuc每孔培養(yǎng)25，000個(gè)Raji PDL1細(xì)胞和1 ng/ml濃度的aCD3/aTAA1。在一些實(shí)驗(yàn)中，Jurkat NFAT FLuc PD1細(xì)胞被替換為Jurkat NFATFLuc PD1 CAR細(xì)胞(每孔50000個(gè)細(xì)胞)或Raji PDL1細(xì)胞被Raji或CHO PDL1 tmaCD3細(xì)胞(25,000個(gè)/孔)。最終，每孔細(xì)胞懸液的體積為100ul。所有的反應(yīng)都在含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中進(jìn)行，加上所有的反應(yīng)原件，培養(yǎng)板在37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h,然后通過(guò)ONEGlo分析系統(tǒng)和SPARK 20M酶標(biāo)儀(Tecan, Switzerland)讀取發(fā)光強(qiáng)度。

?數(shù)據(jù)處理

?根據(jù)方程，利用四參數(shù)logistic近似配位函數(shù)繪制細(xì)胞活化對(duì)抗體濃度的依賴關(guān)系曲線:：

?其中x為抗體濃度，ng/ml;max是上漸近線;?min是下漸進(jìn)曲線，坡面是曲線的曲率，EC50為半有效濃度，ng/ml。

這些圖是用SigmaPlot程序包(SYSTAT軟件)近似擬合得到的。所有的實(shí)驗(yàn)測(cè)量至少進(jìn)行了兩次。圖中所示值為所有重復(fù)的平均值;誤差條是標(biāo)準(zhǔn)差。

? ? ?? aPD1和aPDL1的穩(wěn)定性

取濃度為25 mg/ml 的aPD1和aPDL1?50 μl，分別置于PCR管中，置于PCR反應(yīng)器中(BioRad, USA)在指定的溫度下加熱處理1h,隨后的分析根據(jù)生物學(xué)功能分析操作指南進(jìn)行。

? ? ?? 生物分析線性范圍

為了比較實(shí)驗(yàn)值與期望值之間的差異，分別根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)最大值，?100μg/ml濃度為100%活性為參照，稀釋aPD1 和 aPDL1抗體濃度分別為最大活性的200, 140, 70, 和50%。再根據(jù)生物學(xué)功能分析操作指南進(jìn)行。活度計(jì)算為標(biāo)準(zhǔn)樣品的實(shí)驗(yàn)測(cè)定的EC50與給定濃度的實(shí)驗(yàn)測(cè)定的EC50之比×100%。

? ? ?? 結(jié)果與分析

? ? ?? 細(xì)胞系的產(chǎn)生

在生物學(xué)分析中，最好使用永生化的細(xì)胞系來(lái)避免元代細(xì)胞準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性的問(wèn)題。也可以通過(guò)基因工程手段得到想要的細(xì)胞表型。一個(gè)用于分析aPD1或 aPDL1抗體生物學(xué)活性的系統(tǒng)中，應(yīng)該包括PD-1+的效應(yīng)細(xì)胞和表達(dá)PD-L1的細(xì)胞。pd1介導(dǎo)的對(duì)CD3依賴激活的抑制意味著效應(yīng)細(xì)胞必須在其表面攜帶有功能的CD3復(fù)合物。為了評(píng)估CD3依賴的激活，報(bào)告系統(tǒng)可以使用，例如熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)。PD-L1和PD-1相互作用的結(jié)果是抑制了依賴于CD3激活的T細(xì)胞的NFAT和NF-κB（核因子，激活B細(xì)胞的κ輕鏈增強(qiáng)子）信號(hào)。最好使用NFAT介導(dǎo)的通路,因?yàn)?/span>NF-κB信號(hào)可以被很多其它物質(zhì)刺激，例如CD3依賴激活的特異性標(biāo)志物較少。

來(lái)自人T細(xì)胞的Jurkat細(xì)胞系符合用于CD3依賴的激活T細(xì)胞研究的要求，已經(jīng)使用多達(dá)30年。在我們中，我們準(zhǔn)備了NFAT FLuc PD1穩(wěn)定細(xì)胞系，可以表達(dá)PD-1并且在NFAT反應(yīng)的啟動(dòng)子下，控制著報(bào)告基因的表達(dá)。

獲得了兩個(gè)PDL1+細(xì)胞系Raji和CHO PDL1 tmaCD3

? ? ?? 選擇一種細(xì)胞激活效應(yīng)的方法

除了效應(yīng)細(xì)胞外，測(cè)試系統(tǒng)還必須包括PDL1和CD3激活因子。利用PDL1+細(xì)胞作為PDL1的載體是目前最常用的物理方法。

? ? ?? 我們的測(cè)試系統(tǒng)已經(jīng)考慮了CD3激活的幾個(gè)變體（圖1）：

? ?? a)T cell受體(TCR)與特定肽形成復(fù)合物和主要組織相容性復(fù)合物(MHC)的相互作用最類似于其自身的作用機(jī)制（圖1a）；

?? b)超級(jí)抗原可以結(jié)合在2型MHC（MHCⅡ）中TCRβ鏈，這一結(jié)構(gòu)模擬了TCR與MHC/Peptide形成復(fù)合物（圖1b）。我們中用SEB作為超級(jí)抗原；

? ? ? c)可溶性的激活性anti-CD3ε抗體最為常用，以激活CD3(圖1.c)；

? ? ? d)跨膜型的anti-CD3ε抗體也經(jīng)常用于aPD1和 aPDL1抗體的生物學(xué)分析（圖1d）；

? ? e)CAR+效應(yīng)細(xì)胞是檢測(cè)aPD1和aPDL1的一個(gè)有趣的選擇。CAR的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域通常包含CD3ζ信號(hào)結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)激活信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，類似于完整的CD3復(fù)合物（圖1e）。據(jù)報(bào)道CAR-T治療結(jié)合PD1/PDL1抑制子更加有效；

? ? ?? f)T細(xì)胞招募型雙特異性抗體也可以用于CD3激活（圖1f）

圖1.CD3激活方法在PD-1/PD-L1相互作用抑制劑生物學(xué)分析方法中的應(yīng)用

由于通過(guò)TCR與MHC/peptide復(fù)合物的相互作用來(lái)激活需要更復(fù)雜的技術(shù)手段，我們不再深入探討.

起初選擇優(yōu)化的CD3激活變體用于生物學(xué)分析開發(fā)，我們比較了可溶性的激活劑，例如αCD3抗體，aCD3/aTAA1,aCD3/aTAA2, 和SEB超抗原（圖2），通過(guò)兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行評(píng)價(jià):絕對(duì)激活(包含效應(yīng)細(xì)胞、靶細(xì)胞、激活劑和aPD1的系統(tǒng)中的發(fā)光強(qiáng)度)和相對(duì)激活(系統(tǒng)中的發(fā)光強(qiáng)度之比，即在上述系統(tǒng)中含有和不含有aPD1二者發(fā)光強(qiáng)度之比)。在含有aCD3/aTAA1和aCD3/aTAA2 激活劑的系統(tǒng)中,發(fā)光強(qiáng)度是含有aCD3 和SEB?激活劑系統(tǒng)發(fā)光強(qiáng)度的2-3倍。需要注意的是aCD3 和SEB?在本實(shí)驗(yàn)中的使用濃度是用于T細(xì)胞招募濃度的1000倍和100倍。與上述CD3激活因子不同，可溶性aCD3激活了所有效應(yīng)細(xì)胞，而不僅僅是那些直接與靶細(xì)胞相互作用的細(xì)胞。當(dāng)使用PDL1+靶細(xì)胞時(shí)，PD1介導(dǎo)的CD3依賴性激活的抑制作用僅在某些效應(yīng)細(xì)胞中存在。這造成了背景信號(hào)和較低的相對(duì)激活。在有aCD3/aTAA1 和aCD3/aTAA2?系統(tǒng)中，相對(duì)激活為5-6倍，aCD3 相對(duì)激活為1.5倍，SEB系統(tǒng)中相對(duì)激活為2倍。因此aCD3 和SEB激活劑相對(duì)于T細(xì)胞招募劑有較低的絕對(duì)激活和相對(duì)激活，在后續(xù)的研究討論中排除。而且SEB屬于有毒物質(zhì)，在生物分析中不太受歡迎，如果有其它替代品時(shí)要慎用SEB.

圖2.可溶性激活劑激活CD3依賴的NFAT信號(hào)

有趣的是，在只有效應(yīng)細(xì)胞和可溶性aCD3組成的系統(tǒng)中加入Raji細(xì)胞可以提高效應(yīng)細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)，這可能是由于aCD3與Raji細(xì)胞上Fc受體相互作用的結(jié)果.

可溶性CD3活化劑相對(duì)于跨膜活化劑分子的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以對(duì)其濃度進(jìn)行優(yōu)化，使體系更加靈活（圖3）。在aCD3/aTAA濃度為0.1-1 ng/ ml的范圍內(nèi)，aPD1對(duì)熒光強(qiáng)度的影響最大。在我們的實(shí)驗(yàn)中，我們使用了1ng /ml的aCD3/aTAA濃度，這提供了最大的相對(duì)激活和最大的亮度絕對(duì)值。

圖3.依賴于aCD3/aTAA的兩種變體的激活系統(tǒng)

此外，我們比較了四種生物測(cè)定法，每一種都基于一種激活方法:aCD3/aTAA的兩種變體、跨膜aCD3的靶細(xì)胞和CAR+ 的效應(yīng)細(xì)胞（圖4）。在含有CAR+效應(yīng)細(xì)胞的系統(tǒng)中，絕對(duì)激活高出其它激活形式的5倍。兩種aCD3/aTAA變體的相對(duì)激活是跨膜激活劑的2-3倍。同時(shí)，aCD3/aTAA1比aCD3/aTAA2的相對(duì)激活度高?；谶@些數(shù)據(jù)，我們選擇aCD3/aTAA1激活CD3。

圖4.不同濃度aPD-1，不同激活劑激活報(bào)告系統(tǒng)

生物測(cè)定表征

為了證明所開發(fā)的生物測(cè)定法的特異性，我們用aPD1、aPDL1、aCTLA4和aHER2進(jìn)行了檢測(cè)（圖5）。在本生物實(shí)驗(yàn)中CD3依賴激活的抑制是通過(guò)效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞上分別存在的PD1和PDL1來(lái)保證的。NF-AT調(diào)控的熒光素酶的表達(dá)，是在加入aPD1 或aPD-L1 重激活效應(yīng)細(xì)胞而實(shí)現(xiàn)的，aCTLA4 或 aHER2?不能實(shí)現(xiàn)效應(yīng)細(xì)胞的重激活。樣品的發(fā)光強(qiáng)度與抗體濃度的關(guān)系可以用四參數(shù)邏輯斯蒂方程來(lái)描述，這使得比較被測(cè)樣品的EC50值成為可能。

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖5.報(bào)告系統(tǒng)特異性驗(yàn)證

為了確定所開發(fā)的生物測(cè)定法鑒別不同活性的PD1/PDL1抑制劑的能力，我們使用了aPD1和aPDL1兩種承受熱應(yīng)力的制劑（圖6）。我們觀察到EC50值與處理溫度之間的直接依賴關(guān)系。因此，本發(fā)明的生物測(cè)定法可以鑒別活性不同的aPD-1和aPDL-1制劑，并可用于其穩(wěn)定性的測(cè)定。

圖6.不同活性抗體對(duì)報(bào)告系統(tǒng)特異性驗(yàn)證

只有在生物測(cè)定線性范圍內(nèi)，才能確定被測(cè)制劑的正確活性。為了確認(rèn)該生物測(cè)定的范圍在50%-200%內(nèi)，以標(biāo)準(zhǔn)值100%激活為基準(zhǔn)，設(shè)置aPD-1 和 aPD-L1?在預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)值50,70.100，140,200% 5個(gè)濃度值激活該系統(tǒng)，測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度（圖7）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些制劑的活性接近預(yù)期值。該系統(tǒng)在aPD-1和aPDL-1標(biāo)準(zhǔn)的50-200%的活性范圍內(nèi)是線性的。

圖7.報(bào)告系統(tǒng)的線性范圍

我們開發(fā)了一種生物測(cè)定法來(lái)評(píng)價(jià)aPD-1和aPDL-1的生物活性。生物測(cè)定包括三種成分（圖8）：(i)在表面呈現(xiàn)PD1的效應(yīng)報(bào)告細(xì)胞系，其基因組中含有NF-AT反應(yīng)元件啟動(dòng)子控制下的螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因;(ii)表面存在PD-L1的細(xì)胞系;(iii)雙特異性aCD3/aTAA抗體，用于激活報(bào)告細(xì)胞系中CD3依賴性NF-AT 信號(hào)，并將報(bào)告細(xì)胞與配體提呈細(xì)胞結(jié)合。

圖8.基于雙特異性T細(xì)胞招募抗體的生物學(xué)分析報(bào)告系統(tǒng)

我們比較了不同的CD3激活途徑，并在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用T細(xì)胞招募抗體作為CD3激活劑時(shí)，aPD-1添加后的相對(duì)激活最大(圖2和圖4)。T細(xì)胞招募抗體的其他優(yōu)點(diǎn)是:低背景信號(hào)(相對(duì)于aCD3)，沒(méi)有額外的基因工程操作(相對(duì)于CAR和tmaCD3)，并且沒(méi)有毒性(相對(duì)于超抗原)。

值得注意的是，T細(xì)胞中CD3激活的兩個(gè)被考慮的變體——雙特異性aCD3/aTAA和CAR ,這是以前在測(cè)試PD1/PDL1抑制劑時(shí)沒(méi)有描述過(guò)的原始方法。早前報(bào)道了基于跨膜aCD3的aPD1或aPDL1活性評(píng)價(jià)系統(tǒng)。然而，這種方法是有專利保護(hù)的，使用范圍有限。我們開發(fā)了可以在aPD-1和aPDL-1開發(fā)階段使用的生物測(cè)定法，用于候選分子的比較和穩(wěn)定性評(píng)估，以及對(duì)許多治療性制劑的表征，以確認(rèn)它們的等價(jià)性，即，通常情況下，80-125%的標(biāo)準(zhǔn)抗體活性，線性范圍符合預(yù)期。

開發(fā)的生物測(cè)定方法可以進(jìn)一步改進(jìn)，例如，通過(guò)使用不穩(wěn)定的熒光素酶來(lái)降低背景信號(hào)。

所提供的關(guān)于不同的激活劑激活CD3的數(shù)據(jù)可以用于開發(fā)新的治療試劑和檢測(cè)方法。

我們已經(jīng)成功地將所開發(fā)的分析方法用于aPD-1和aPDL-1候選治療藥物的選擇和表征，目前正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)。

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