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雙特異性抗體與T細(xì)胞重定向

使用雙特異性抗體分子進(jìn)行T細(xì)胞重定向，是非常有前景的腫瘤治療策略。

雙特異性抗體，約50%為CD3靶向的雙特異性抗體（BsAb），包括catumaxomab (Removab?, Epcam x CD3, Trion Research GmbH,approved in the European Union in 2009),銜接T細(xì)胞的雙特異性抗體（BiTE）blinatumomab (Blincyto?, CD19xCD3,Micromet/Amgen, approved by the US Food and Drug Adiministration in 2015）。50kDaBiTE被設(shè)計(jì)成在一個(gè)多肽鏈中有兩個(gè)單鏈可變片段(ScFv)結(jié)構(gòu)域。此外，正在研究從納米抗體(25 KDa)到IgG-融合(≥150 kDa)的多種形式。

雖然較小的分子具有連接細(xì)胞間距離較短的優(yōu)點(diǎn)，并且可以顯示更好的腫瘤穿透性，但需要進(jìn)行Fc改造，通過(guò)FcRn介導(dǎo)的循環(huán)和調(diào)節(jié)Fc活性來(lái)控制血清的半衰期。?

T細(xì)胞殺傷活性需要形成免疫突觸（ISs），是將T細(xì)胞鏈接到呈遞有多肽-MHC復(fù)合物的目標(biāo)細(xì)胞。激活的的免疫突觸，導(dǎo)致釋放的細(xì)胞毒性顆粒和細(xì)胞因子.由于空間鄰近T細(xì)胞和靶細(xì)胞在ISs形成過(guò)程中，大分子如CD45被排除在膜間之外空間。這允許細(xì)胞間距離為15 nm，與IgG 1的Fab臂的距離大致相同。

使用BsAb的T細(xì)胞重定向需要模仿IS，這是通過(guò)與靶細(xì)胞表面抗原結(jié)合的CD3與靶細(xì)胞結(jié)合來(lái)橋接T細(xì)胞受體復(fù)合物來(lái)實(shí)現(xiàn)的。多種因素可以影響T細(xì)胞重定向活動(dòng)，如靶向臂的差異親和力，如CLL1xCD3 knob-in-hole IgG1BsAb的例子所示。MCSPxCD3 BiTE和FcRH5xCD3BsAb的表位結(jié)合距離也很重要。

在針對(duì)5T4膜近端結(jié)構(gòu)域的T細(xì)胞上，在嵌合免疫受體(CIR)的胞外部分插入Fc-based linker也能增強(qiáng)T細(xì)胞的活化和靶細(xì)胞殺傷。相反，在沒(méi)有Fc-based linker情況下，表達(dá)CIR時(shí)，針對(duì)CD19的T細(xì)胞被激活到更高的水平，但沒(méi)有更有效地殺傷靶細(xì)胞。因此，結(jié)構(gòu)特征，如與膜的抗原表位的可及性和距離以及bsAb的靈活性，對(duì)有效的T細(xì)胞重定向有重要影響。

IgG亞型結(jié)構(gòu)差別

BsAb的IgG亞型也會(huì)由于可變區(qū)域展示、鉸鏈序列和二硫鍵結(jié)構(gòu)的變化而影響其功能活性。IgG的鉸鏈區(qū)連接Fc結(jié)構(gòu)域和Fab結(jié)構(gòu)域，每個(gè)IgG亞類的長(zhǎng)度、序列和二硫鍵結(jié)構(gòu)各不相同。

IgG1具有較長(zhǎng)的鉸鏈區(qū)，有兩個(gè)二硫鍵。IgG2的鉸鏈區(qū)最短，也是最堅(jiān)硬的，因?yàn)樗嬖谟谌齻€(gè)主要異構(gòu)體中的四個(gè)二硫鍵。IgG4的鉸鏈與IgG2的鉸鏈區(qū)氨基酸長(zhǎng)度相同（12個(gè)氨基酸），但含有更多的脯氨酸，而不是半胱氨酸殘基，并且只有一個(gè)類似IgG1的二硫鍵結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)變化影響著IgG鉸鏈區(qū)的柔韌性，IgG1>IgG4>IgG2。IgG1是柔韌性最好的（由電子顯微鏡觀測(cè)）。用小角度X射線散射(SAXS)分析不同IgG亞bAb結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象。IgG1分子是封閉Y、中間Y/T和廣泛開(kāi)放T構(gòu)象的等量混合物。IgG4分子以Y/T構(gòu)象為主，而IgG 2分子以Y構(gòu)象為主。盡管IgG1、IgG2和IgG4亞型被用作治療生物制劑的框架,IgG亞型對(duì)T細(xì)胞重定向的影響未詳細(xì)研究。

IgG亞型對(duì)T細(xì)胞重定向研究

分子設(shè)計(jì)

Janssen BioTherapeutics的科學(xué)家，通過(guò)controlled Fab-arm exchange (cFAE)技術(shù)，建立IgG1，IgG2，IgG4三種亞型的CD3XCD19雙特異性抗體。結(jié)合CD19膜遠(yuǎn)端結(jié)構(gòu)域的親本抗體是以人源化的blinatumomab（博納吐單抗）為基礎(chǔ)的，結(jié)合CD3e鏈的親本抗體是基于OKT3的可變區(qū)。為了盡可能減少Fcγ受體（FcγR）的影響，采用Fc突變，減少其與FcγR的結(jié)合：IgG1 FES, IgG2 σ1and IgG4 PAA。

設(shè)計(jì)兩個(gè)IgG亞型，將IgG1和IgG4的F（ab）2包含鉸鏈區(qū)融合到IgG2 σ1-Fc (命名為 IgG1:2 σ1 and IgG4:2 σ1）。

所有亞型的蛋白質(zhì)和細(xì)胞結(jié)合通過(guò)SPR和流式細(xì)胞術(shù)來(lái)進(jìn)行。BsAb能將T細(xì)胞連接到其各自的靶細(xì)胞，并抑制靶細(xì)胞的增殖，以此評(píng)價(jià)其體外活性。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)

1.?各亞型雙特性抗體分子質(zhì)量控制

RSV：specificity control

2.?各亞型BsAb和Fc受體的結(jié)合能力

FcRn結(jié)合不受影響，因而對(duì)藥物血液半衰期沒(méi)有影響。所有由IgG2σ1 Fc組成的分子與FcγRs相互作用最少。在抗體依賴細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和抗體依賴的細(xì)胞吞噬作用等多種體外功能試驗(yàn)中，IgG 2σ1與FcγRs的相互作用有限，在體外轉(zhuǎn)化為低活性或無(wú)活性。

3.?各亞型BsAb和抗原、CD19B細(xì)胞淋巴瘤、T細(xì)胞結(jié)合力

HBL-1：CD19-expressing B-cell lymphoma lines (low CD19 receptor density(RD)

Daudi：(high CD19 RD)

所有分子單臂親和力<3X范圍內(nèi)，表明IgG亞類和分子形式(抗體與BsAb)對(duì)體外親和力均無(wú)顯著影響。同樣，CD19各IgG亞類細(xì)胞結(jié)合是平等的，與CD19RD和RFP-轉(zhuǎn)導(dǎo)無(wú)關(guān).由于二價(jià)IgGs比與BsAb的結(jié)合弱2-3倍，這些觀察表明分子的親和力很小。相反，CD3特異性BsAb結(jié)合T細(xì)胞的能力比他們的雙價(jià)親本抗體弱10倍，提示CD3的親和力比CD19更強(qiáng)。這可能是由抗原本身驅(qū)動(dòng)的，特別是特定的抗原表位，它們?cè)试SCD3的二價(jià)結(jié)合，而不是CD19的二價(jià)結(jié)合。

4. 各抗體亞型細(xì)胞聚合能力

5. 各IgG亞型抑制B細(xì)胞淋巴瘤增殖能力?

概括

雙特異性抗體(BsAbs)介導(dǎo)的T細(xì)胞重定向是一種很有前途的腫瘤治療方法。雙重抗原結(jié)合對(duì)T細(xì)胞的重定向是必需的，并受依賴于其IgG亞類的BsAb的結(jié)構(gòu)特性的影響。在本研究中，針對(duì)CD19xCD3的BsAb是在攜帶Fc突變的IgG1、IgG2和IgG4的變異體中產(chǎn)生的，它們減少了FcγR的相互作用（避免CDC，ADCC等副作用），兩種嵌合IgG亞型為IgG 1：2和IgG 4：2，其中IgG 1-或IgG 4-F(Ab)2被嫁接在IgG 2 Fc上。含有IgG 2或IgG 4-F(Ab)2結(jié)構(gòu)域的分子是結(jié)構(gòu)最緊密的分子。所有的BsAb都被證明與它們的目標(biāo)蛋白(和相應(yīng)的細(xì)胞)結(jié)合得同樣好。然而，CD19xCD3?IgG 2不能同時(shí)結(jié)合這兩種抗原，這是由于T細(xì)胞沒(méi)有與靶細(xì)胞聚集。這意味著IgG2 BsAb在T細(xì)胞重定向試驗(yàn)中的作用減弱.IgG 4：2和IgG 1：2嵌合亞型IgG2BsAb的活性完全恢復(fù)。這證實(shí)了F(Ab)2區(qū)對(duì)BsAb功能活性的重要貢獻(xiàn)，表明不同F(xiàn)c和F(Ab)2結(jié)構(gòu)域的工程改造分子可以調(diào)控BsAb的功能。?

核心內(nèi)容總結(jié)

IgG2型因?yàn)殂q鏈區(qū)短且柔韌性差，如果整體雙特異性抗體亞型為IgG2，則T細(xì)胞的重定向效果最差。但I(xiàn)gG2型Fc和FcγRs結(jié)合最弱，可以引起最小的毒副作用。

將IgG1和IgG4含鉸鏈區(qū)的F（ab）2和IgG2的Fc段連接成嵌合分子，則可以將T細(xì)胞重定向和最小毒副作用兩個(gè)優(yōu)勢(shì)結(jié)合在一起。并且減少使用突變技術(shù)改造Fc段，因?yàn)橛醒芯繄?bào)道突變，可以改變抗體藥物的免疫毒性，引起臨床毒性反應(yīng)。采用IgG2天然的Fc段可以一定程度解決這個(gè)問(wèn)題。?

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