來(lái)源：Biotech VentereCapital ?

1.?介紹?

生物技術(shù)的進(jìn)步導(dǎo)致抗體生產(chǎn)和重組技術(shù)的改進(jìn)，推動(dòng)了抗體和無(wú)數(shù)抗體結(jié)構(gòu)的開發(fā)。目前，美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)了72種抗體，其中30種已注冊(cè)用于治療癌癥患者?？贵w在癌癥治療中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。對(duì)于抗體以及如何改變它們的藥代動(dòng)力學(xué)和物理化學(xué)性質(zhì)的理解不斷深入。在抗體作為標(biāo)準(zhǔn)治療方法建立后，越來(lái)越復(fù)雜的抗體結(jié)構(gòu)被開發(fā)出來(lái)。除了完整的免疫球蛋白G (IgG)抗體、首個(gè)抗體藥物偶聯(lián)物和雙特異性抗體(bsAb)已被批準(zhǔn)用于治療癌癥患者，其他一些抗體結(jié)構(gòu)藥物正處于臨床試驗(yàn)中(圖1)。?

?圖1.目前在臨床試驗(yàn)中評(píng)估的抗體結(jié)構(gòu)和bsAb結(jié)構(gòu)示意圖。（A）IgG抗體結(jié)構(gòu)由Fab和Fc區(qū)組成。該Fab區(qū)的結(jié)合部分稱為單鏈可變片段（scFv）?？贵w存在兩條重鏈（VH和CH）和兩條輕鏈（VL和CL）。這些重輕鏈可以通過(guò)可變區(qū)（VH和VL）和恒定區(qū)（CH和CL）進(jìn)行細(xì)分。（B）隨機(jī)重-?輕鏈配對(duì)可能產(chǎn)生的不同組合。（C）目前已批準(zhǔn)或正在臨床試驗(yàn)中的雙特異性抗體結(jié)構(gòu)
標(biāo)準(zhǔn)的人體抗體是一種專一性抗體，它的兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)都針對(duì)同一靶標(biāo)。bsAb是一個(gè)更為復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，其結(jié)合位點(diǎn)針對(duì)不同的作用靶標(biāo)。這使其能夠?qū)崿F(xiàn)一些新穎獨(dú)特的作用機(jī)制，如使免疫細(xì)胞參與殺傷腫瘤細(xì)胞，向腫瘤細(xì)胞遞送有效載荷，或者阻斷腫瘤細(xì)胞重要的信號(hào)通路(圖2)。每一種作用機(jī)制都需要通過(guò)修飾bsAb獲得理想的藥代動(dòng)力學(xué)特性。關(guān)于這些bsAb結(jié)構(gòu)及其作用機(jī)制已經(jīng)發(fā)表了大量的臨床前研究數(shù)據(jù)。

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圖2.在腫瘤學(xué)臨床試驗(yàn)中提出的雙特異性抗體（bsAbs）作用機(jī)制的簡(jiǎn)化示意圖。1.免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。免疫細(xì)胞可以與腫瘤細(xì)胞結(jié)合。2.靶向性遞送有效載荷。用對(duì)腫瘤和有效載荷都具有親和力的bsAb靶向腫瘤細(xì)胞。3.阻斷信號(hào)。bsAb阻斷兩個(gè)信號(hào)。
在腫瘤學(xué)領(lǐng)域，已有兩種雙特異性抗體（bsAbs）被批準(zhǔn)用于臨床。Catumaxomab靶向上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)和CD3, 2009年被歐洲藥物管理局(EMA)批準(zhǔn)用于治療惡性腹水。然而，應(yīng)MAH的要求，Catumaxomab的市場(chǎng)授權(quán)于2017年6月撤銷。Blinatumomab是靶向CD19和CD3的雙特異性抗體，于2014年12月獲FDA批準(zhǔn)，2015年12月獲EMA批準(zhǔn)用于治療費(fèi)城染色體陰性B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL) 。在腫瘤之外，結(jié)合凝血因子IXa和X的bsAb emicizumab于2017年11月被FDA批準(zhǔn)，并于2018年3月被EMA批準(zhǔn)用于治療血友病A。
目前，包括blinatumomab在內(nèi)的57種bsAbs正在用于癌癥患者的臨床試驗(yàn)中，其中38種使用相同的作用機(jī)制:促進(jìn)免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。在剩下的19個(gè)進(jìn)行臨床試驗(yàn)的bsAbs中，5個(gè)雙特異抗體的作用機(jī)制是向腫瘤遞送有效載荷，14個(gè)雙特異性抗體的作用機(jī)制是阻斷癌癥微環(huán)境中的信號(hào)通路。
本綜述的目的有兩個(gè):1)通過(guò)總結(jié)bsAbs的腫瘤臨床開發(fā)來(lái)評(píng)估雙特異抗體的結(jié)構(gòu)選擇;

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? 2)明確雙特異性抗體在腫瘤臨床開發(fā)中所面臨的挑戰(zhàn)。

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2.生產(chǎn)雙特異性抗體

單抗的兩個(gè)結(jié)合區(qū)域針對(duì)同一表位。因此，單抗是雙價(jià)且具有靶標(biāo)單一性。相反，bsAbs具有能結(jié)合兩個(gè)不同的靶標(biāo)的表位，根據(jù)其結(jié)構(gòu)的不同，可以是單價(jià)的，也可以是雙價(jià)的。
單抗通常由雜交瘤細(xì)胞系表達(dá)，雜交瘤細(xì)胞系是分泌抗體的B細(xì)胞和永生的骨髓瘤細(xì)胞系的融合體。BsAbs可以通過(guò)融合兩個(gè)雜交瘤細(xì)胞系而產(chǎn)生，其結(jié)果是產(chǎn)生IgG分子的混合物。此外雙抗還可以通過(guò)組合兩種現(xiàn)有抗體或它們的片段來(lái)產(chǎn)生。另一種因其靈活性而廣受歡迎的選擇是使用重組蛋白。使用遺傳工程化重組蛋白質(zhì)創(chuàng)造了關(guān)于起源組成和生產(chǎn)系統(tǒng)。例如，這些蛋白質(zhì)可以用來(lái)控制重鏈和輕鏈的結(jié)合?；镜腷sAb結(jié)構(gòu)包括來(lái)自一種抗體的重輕鏈對(duì)和來(lái)自另一種抗體的重輕鏈對(duì)。當(dāng)這四個(gè)單獨(dú)的鏈結(jié)合在一起時(shí)，它們隨機(jī)結(jié)合，可以產(chǎn)生16種IgG分子的組合。其中的兩種組合產(chǎn)生了所需的bsAbs結(jié)構(gòu)，其異質(zhì)二聚重鏈與來(lái)自同一抗體的特定輕鏈結(jié)合(圖1B)。嵌合四聚體、常見(jiàn)的輕鏈和重組蛋白可以通過(guò)限制締合的選擇來(lái)提供解決方案。嵌合四聚體具有受物種限制的重-輕鏈配對(duì)。此外，使用普通的輕鏈也可以防止不必要的重輕鏈組合。重組蛋白可以通過(guò)多種途徑促進(jìn)重輕鏈與重鏈的正確結(jié)合。
例如，孔內(nèi)旋鈕方法，其中一個(gè)重鏈?zhǔn)怯梢粋€(gè)由相對(duì)較大的氨基酸組成的旋鈕設(shè)計(jì)的，而另一個(gè)重鏈?zhǔn)怯梢粋€(gè)由相對(duì)較小的氨基酸組成的孔設(shè)計(jì)的。其他的例子是由肽鏈連接片段的結(jié)構(gòu)，例如雙特異性T細(xì)胞銜接器(BiTE)分子，從而繞過(guò)鏈的隨機(jī)關(guān)聯(lián)。?

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?3.合理的設(shè)計(jì)

就像抗體一樣，bsAb可以通過(guò)無(wú)數(shù)種方式進(jìn)行修飾，自定義其功能，增強(qiáng)其功效，如調(diào)節(jié)抗體的免疫原性、效應(yīng)函數(shù)和半衰期。
關(guān)于調(diào)節(jié)免疫原性的問(wèn)題，抗體結(jié)構(gòu)中來(lái)源于小鼠的能產(chǎn)生免疫原性的結(jié)構(gòu)常常被人類的相同結(jié)構(gòu)替代，以降低自身免疫原性。這導(dǎo)致了嵌合人源化抗體結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。越來(lái)越多的全人源化抗體生產(chǎn)出來(lái)，通常是通過(guò)噬菌體展示或產(chǎn)生人類IgG的轉(zhuǎn)基因小鼠。利用噬菌體展示，篩選表達(dá)抗體部分的噬菌體文庫(kù)，以確定其與抗原的親和力。其他能夠引起免疫原性的抗體結(jié)構(gòu)的部分是外來(lái)氨基酸序列，可能是由新的蛋白質(zhì)工程引入的。
關(guān)于抗體的效應(yīng)功能，F(xiàn)c區(qū)域在介導(dǎo)這一過(guò)程中起著重要作用。該區(qū)域參與免疫介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷機(jī)制，如補(bǔ)體依賴的細(xì)胞毒性和抗體依賴的細(xì)胞毒性。與靶向腫瘤細(xì)胞的抗體不同的是，結(jié)合免疫細(xì)胞的抗體被設(shè)計(jì)用來(lái)減輕這種細(xì)胞殺傷作用。腫瘤細(xì)胞靶向抗體需要一個(gè)功能Fc區(qū)域來(lái)殺死目標(biāo)細(xì)胞。
糖工程和改變Fc區(qū)氨基酸序列可以影響免疫介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷機(jī)制。這些技術(shù)可以通過(guò)抗體增強(qiáng)或減少免疫介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷，這取決于修飾抗體的聚糖和氨基酸的位置和功能。除了消除通過(guò)免疫介導(dǎo)的細(xì)胞殺傷，整個(gè)Fc區(qū)域也可以被刪除，從而區(qū)分出帶有Fc區(qū)域的抗體和缺乏Fc區(qū)域的抗體。這種去除Fc的抗體的分子量大大降低，進(jìn)而影響了抗體的藥物動(dòng)力學(xué)特性，包括抗體清除和腫瘤穿透性。
完整的IgG抗體大小約為150 kDa，由肝臟清除，而分子量低于60 kDa的蛋白質(zhì)則由腎臟清除。腎清除比肝清除快?？贵w的大小也可以通過(guò)移除Fab中非結(jié)合區(qū)域CL和CH1區(qū)域。如果從結(jié)構(gòu)中刪除非結(jié)合區(qū)域，則只保留必要的結(jié)合區(qū)域，即可變區(qū)片段。這些由一個(gè)單一的肽鏈連接在一起的可變區(qū)片段稱為單鏈可變片段(scFv) 。由于ScFvs體積小且缺乏新生兒受體，因此可以迅速?gòu)捏w內(nèi)循環(huán)中清除。因此，當(dāng)患者治療時(shí)為了保持一個(gè)恒定的血藥濃度，必須持續(xù)使用scFvs。此外，scfv可以作為構(gòu)建單元來(lái)創(chuàng)建bsAbs(圖1C)。
除了增加抗體結(jié)構(gòu)的大小，其他延長(zhǎng)抗體半衰期的方法包括與白蛋白融合或與白蛋白結(jié)合、與聚乙二醇片段結(jié)合以及融合Fc。幾種雙特異性結(jié)構(gòu)與人血清白蛋白融合后，在小鼠模型中增加了半衰期。此外，在雙特異性抗體中添加Fc區(qū)域可以避免由于快速清除而需要對(duì)小型抗體進(jìn)行連續(xù)給藥。在非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，通過(guò)融合Fc區(qū)域，將不同BiTEs的血清半衰期從6 h延長(zhǎng)到44-167 h 。
雙特異性抗體和標(biāo)準(zhǔn)單抗的差別在于雙抗主要作用于兩個(gè)不同的靶標(biāo)。二價(jià)結(jié)合增加了抗體活性，并可影響其藥效學(xué)。雙價(jià)抗體可誘導(dǎo)抗體依賴的二聚化，其中一個(gè)例子是一種可以阻斷間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子(MET)激酶信號(hào)。當(dāng)然，經(jīng)過(guò)改造的單價(jià)抗體也可以阻斷MET受體的二聚化和下游信號(hào)的激活。
以CD3為靶點(diǎn)的二價(jià)抗體會(huì)誘導(dǎo)T細(xì)胞間的交聯(lián)，導(dǎo)致T細(xì)胞裂解。但是，靶向CD3的單價(jià)抗體在體外卻不會(huì)誘導(dǎo)T細(xì)胞裂解。為防止接受腎移植的患者出現(xiàn)排斥反應(yīng)，一種靶向CD3的二價(jià)抗體可以發(fā)揮耗盡T細(xì)胞的作用，但是也會(huì)引起嚴(yán)重的細(xì)胞因子反應(yīng)。而用于腫瘤治療的能招募免疫細(xì)胞參與的bsAbs主要依賴于免疫細(xì)胞，發(fā)揮抗腫瘤作用因而要避免免疫細(xì)胞衰竭，所以這類bsAbs大都用單價(jià)抗體和CD3結(jié)合。

4.招募免疫細(xì)胞

對(duì)癌癥免疫治療興趣的日益增長(zhǎng)推動(dòng)了招募免疫細(xì)胞的bsAbs的發(fā)展。bsAb blinatumomab使免疫細(xì)胞與ALL病人的B細(xì)胞結(jié)合。它能招募表達(dá)CD3抗原的T細(xì)胞，CD3抗原是T細(xì)胞的一般標(biāo)記物。T細(xì)胞通過(guò)靶向腫瘤相關(guān)抗原(TAA)與腫瘤結(jié)合。對(duì)于blinatumomab來(lái)說(shuō)，TAA是CD19，CD19是B細(xì)胞的一種標(biāo)志物。一般情況下，TAA應(yīng)該是針對(duì)腫瘤細(xì)胞的，使健康組織不受傷害。TAA并不一定在癌癥的發(fā)病機(jī)制中起作用;其主要作用是在在免疫細(xì)胞參與的情況下，在腫瘤細(xì)胞膜上提供一個(gè)能夠結(jié)合的位點(diǎn)。
免疫細(xì)胞參與bsAbs的應(yīng)用已經(jīng)探索了30多年。最近，blinatumomab證實(shí)了免疫細(xì)胞參與的bsAbs治療血液學(xué)惡性腫瘤的潛力。在一項(xiàng)隨機(jī)研究中，ALL（heavily pretreated B cell precursor）患者均使用blinatumomab單抗治療，中位生存時(shí)間為7.7個(gè)月，而化療治療組的中位生存時(shí)間為4.0個(gè)月(表2)。大多數(shù)臨床試驗(yàn)中的bsAbs都是招募免疫細(xì)胞參與的;在ClinicalTrials.gov上報(bào)道的57例腫瘤相關(guān)的bsAbs中，有38例屬于這種類型(圖3)。

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4.1 CD3+ T細(xì)胞參與的雙特異性抗體

在進(jìn)行腫瘤臨床試驗(yàn)的38種通過(guò)招募免疫細(xì)胞發(fā)揮作用的雙特異性抗體中，有36種是通過(guò)與T細(xì)胞受體CD3結(jié)合招募T細(xì)胞發(fā)揮抗腫瘤作用，在這些雙特異性抗體中有18種針對(duì)惡性血液瘤的靶點(diǎn)，16種以實(shí)體瘤為靶點(diǎn)。
當(dāng)T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞都被bsAb結(jié)合時(shí)，就形成了一個(gè)溶細(xì)胞突觸。在這個(gè)細(xì)胞水解突觸中，T細(xì)胞釋放穿孔素和細(xì)胞毒性顆粒酶-b，導(dǎo)致靶細(xì)胞死亡，這一機(jī)理已在體外得到證實(shí)，并已通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察到。在沒(méi)有靶細(xì)胞的情況下與T細(xì)胞結(jié)合并不會(huì)激活T細(xì)胞，這與體外用人外周血單核細(xì)胞(PBMCs)和BITE進(jìn)行的T細(xì)胞活化和細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果一致。
然而，當(dāng)表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)陽(yáng)性和陰性的癌細(xì)胞在體外混合并用于建立人類異種移植小鼠模型時(shí)，結(jié)合CD3和EGFR的BITE也會(huì)導(dǎo)致EGFR陰性細(xì)胞的死亡。這說(shuō)明BITE治療也能引起非TAA表達(dá)腫瘤細(xì)胞的殺傷。
臨床前研究表明，免疫檢查點(diǎn)參與緩解了血液病患者對(duì)招募免疫細(xì)胞的bsAbs的反應(yīng)。將以CD33和CD3為靶點(diǎn)的BITE結(jié)構(gòu)雙抗AMG330加入到從患者收集的原發(fā)性急性髓系白血病(AML)細(xì)胞和PBMCs的共培養(yǎng)中，促進(jìn)了以AML細(xì)胞為主的程序性死亡配體1 (PD-L1)表達(dá)的上調(diào)(Krupka et al.，2016)。在這些患者樣本中添加抗pd -1和/或抗pd - L1抗體可增強(qiáng)雙抗對(duì)AML細(xì)胞的殺傷。在食蟹猴中， 采用靶向全長(zhǎng)CD3和B細(xì)胞譜系標(biāo)記物FcRH5的bsAb治療多發(fā)性骨髓瘤，檢測(cè)到血、脾、淋巴結(jié)和骨的PD1 + CD8+ T細(xì)胞增加及B細(xì)胞的消除。將該bsAb在體外與抗PD-L1抗體聯(lián)用，可以增加轉(zhuǎn)染PD-L1編碼質(zhì)粒的腫瘤細(xì)胞的裂解。
在許多具有功能免疫系統(tǒng)的實(shí)體瘤小鼠模型中，已經(jīng)觀察到免疫細(xì)胞參與的bsAbs對(duì)腫瘤的反應(yīng)。在這些研究中，選擇了廣泛的TAAs，包括已建立的腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原(CEA)、EpCAM、人表皮生長(zhǎng)因子受體2 (HER2)和EGFR。然而，關(guān)于免疫細(xì)胞參與的bsAbs在人類實(shí)體瘤中的臨床療效數(shù)據(jù)卻很少。
一個(gè)值得一提的例子是雙特異性抗體IMCgp100，它能結(jié)合CD3及黑色素瘤相關(guān)抗原糖蛋白-100 (gp100)。IMCgp100的雙特異性抗體ImmTAC以T細(xì)胞受體(TCR)而不是抗體的Fab區(qū)域作為表面蛋白gp100的靶點(diǎn)。TCRs的使用能夠靶向主要組織相容性復(fù)合體分子所表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)癌蛋白。然而，多克隆T細(xì)胞的反應(yīng)，如cd3參與的bsAbs所產(chǎn)生的反應(yīng)，被排除在外。針對(duì)細(xì)胞內(nèi)wt1蛋白的特異性TCR與靶向CD3的scFv結(jié)構(gòu)的雙特異性抗體，在人類白血病和實(shí)體癌的異種移植小鼠模型顯示了療效。
一種稍微不同的方法是使用武裝了T細(xì)胞的bsAb。HER2Bi就是一個(gè)例子，它是一種bsAb，由靶向HER2和CD3的兩個(gè)連接抗體組成。在一期研究中，從患者身上提取T細(xì)胞，與bsAb一起培養(yǎng)。然后將T細(xì)胞和bsAb重新注入病人體內(nèi)。由于離體環(huán)境中與T細(xì)胞結(jié)合的條件可控，bsAb的潛在需求更少，副作用的幾率可能會(huì)降低。一期臨床研究證實(shí)了相對(duì)溫和的副作用，并顯示出通常參與抗腫瘤免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子增加水平(表2)。
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???4.2招募CD3+ T細(xì)胞參與的bsAbs與免疫系統(tǒng)的相互作用

一般來(lái)說(shuō)，動(dòng)員T細(xì)胞的bsAbs破壞其靶細(xì)胞是獨(dú)立于共刺激信號(hào)之外的，如在體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)中，在抗cd3×抗cd19 bsAb存在的情況下，人PBMCs誘導(dǎo)人淋巴瘤細(xì)胞系的死亡。然而，添加一種共刺激信號(hào)，例如白細(xì)胞介素-2，可以增強(qiáng)效力，特別是當(dāng)PBMC與共刺激信號(hào)共培養(yǎng)時(shí)。同樣，靶向共刺激分子CD137和CD28作為一種聯(lián)合治療，可以改善招募免疫細(xì)胞的bsAbs的殺傷腫瘤細(xì)胞作用。將抗cd137和抗cd20的雙抗與抗cd3和抗cd20的雙抗聯(lián)用，在攜帶人類淋巴瘤異種移植瘤的小鼠中顯示出協(xié)同作用。然而，單獨(dú)使用CD137×CD3 bsAb并不能降低腫瘤的生長(zhǎng)。
除了共刺激分子，共抑制分子也被認(rèn)為阻礙了招募免疫細(xì)胞參與的bsAbs的作用。BsAb RO6958688，以CEA和CD3為靶點(diǎn)的2:1 CrossMab結(jié)構(gòu)的雙抗，在與PBMCs聯(lián)合移植的小鼠體內(nèi)增加了T細(xì)胞向異種移植結(jié)腸癌的浸潤(rùn)。此外，給予該bsAb可將PD-L1陰性腫瘤轉(zhuǎn)化為PD-L1陽(yáng)性腫瘤。同樣的結(jié)果也出現(xiàn)在了使用ERY974（一個(gè)針對(duì)glypican-3和CD3的IgG形式的bsAb）治療移植了轉(zhuǎn)染人類糖皮質(zhì)激素-3的肺癌和肝癌細(xì)胞的表達(dá)人類CD3轉(zhuǎn)基因小鼠腫瘤模型。在T細(xì)胞和一組腫瘤細(xì)胞系的體外共培養(yǎng)中，無(wú)論初始表達(dá)水平如何，靶向CD3和CEA的BiTE均可誘導(dǎo)T細(xì)胞上的PD1表達(dá)和腫瘤細(xì)胞上的PD-L1表達(dá)?？筽d1和抗pd - L1抗體的加入增強(qiáng)了BITE抗體的活性。
在體外實(shí)驗(yàn)中，HER2-TBD一種抗her2 x抗cd3的bsAb對(duì)轉(zhuǎn)染PD-L1的HEK293腫瘤細(xì)胞的殺傷活性降低。在該研究中，給予該bsAb聯(lián)合PD-L1阻斷抗體可恢復(fù)bsAb的細(xì)胞毒性潛能。接下來(lái)，在表達(dá)人CD3的轉(zhuǎn)基因小鼠的同源腫瘤模型中，單獨(dú)使用抗her2 x抗CD3 bsAb或聯(lián)合抗pd -L1抗體使用，作用于轉(zhuǎn)染的人her2的CT26腫瘤。聯(lián)合治療也能更有效地控制腫瘤生長(zhǎng)。結(jié)合CD3與TROP-2靶點(diǎn)的Fab(2)-scFv雙抗聯(lián)合抗pd1抗體在MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞株小鼠體內(nèi)異種移植瘤模型中顯示了協(xié)同作用。
潛在的免疫細(xì)胞參與的bsAbs提高了T細(xì)胞對(duì)實(shí)體腫瘤的滲透作用，最新的證據(jù)表明抑制PD1 / PD-L1軸可以加強(qiáng)bsAbs的作用,這些結(jié)果促使了在I期臨床試驗(yàn)中評(píng)估招募免疫細(xì)胞參與的bsAbs聯(lián)合檢查點(diǎn)抑制劑的療效,特別是和anti-PD-L1抗體聯(lián)用的效果(表3)。
RO6958688是一種針對(duì)CEA和CD3的bsAb，聯(lián)合抗pdl1抗體atezolizumab治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌臨床結(jié)果顯示了聯(lián)用具有增強(qiáng)活性的效果。單獨(dú)用RO6958688治療的31名患者中有2名患者部分反應(yīng)，而組合治療組的14名患者中有3名患者部分反應(yīng)，未發(fā)現(xiàn)額外增加的毒性。?

?4.3招募其他免疫受體細(xì)胞

除T細(xì)胞外，其他效應(yīng)細(xì)胞或免疫細(xì)胞亞群也可參與腫瘤細(xì)胞的作用。有許多CD3 + T細(xì)胞亞型，并不是所有的都有助于抗腫瘤免疫反應(yīng)。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)抑制活化的T細(xì)胞。42例B細(xì)胞ALL患者在blinatumomab單抗治療前外周血中treg的含量與治療反應(yīng)呈負(fù)相關(guān)。在體外，blinatumomab激活了抑制效應(yīng)T細(xì)胞細(xì)胞毒性的Tregs 。阻止Tregs的活化是CD8+ T細(xì)胞與前列腺干細(xì)胞抗原串聯(lián)結(jié)合的scFv結(jié)構(gòu)雙抗背后的理論之一。這種bsAb確實(shí)在體外誘導(dǎo)了人前列腺腫瘤細(xì)胞株的裂解，但與CD3+ T細(xì)胞與人PBMCs和分離的CD8+ T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)相比，bsAb的裂解效果較差。
具有作用于T細(xì)胞受體CD28與CD20的bsAb在體外的幾種淋巴瘤細(xì)胞株和PBMCs共培養(yǎng)體系里面顯示了強(qiáng)勁的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。BITE樣結(jié)構(gòu)雙抗RM28以CD28和TAA黑色素瘤相關(guān)蛋白聚糖為靶點(diǎn)，作用于黑色素瘤細(xì)胞。在2007年完成的一期臨床試驗(yàn)中，這種bsAb被用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的腫瘤內(nèi)治療(NCT00204594)，但結(jié)果尚不清楚。
BsAbs也被開發(fā)用于靶向自然殺傷細(xì)胞(NK)，這是一種天然免疫系統(tǒng)的強(qiáng)細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞。一項(xiàng)針對(duì)AFM13霍奇金淋巴瘤患者的一期試驗(yàn)已經(jīng)完成，這是一種針對(duì)CD30和CD16的串聯(lián)diabody (TandAb)結(jié)構(gòu)。在該研究中，外周血NK細(xì)胞活化，可溶性cd30降低，26例患者中有3例出現(xiàn)部分緩解(Rothe et al.，2015)(表2)。
通過(guò)在抗CD33和抗CD16結(jié)構(gòu)之間引入IL-15修飾的bsAb結(jié)構(gòu)(圖1C) 與未修飾的bsAb相比，它具有更好的體外抗腫瘤活性，提高了人NK細(xì)胞的存活率。目前計(jì)劃對(duì)CD33+髓系惡性腫瘤患者進(jìn)行一項(xiàng)三特異性結(jié)構(gòu)161,533的試驗(yàn)(表S1)。

?5.?有效載荷遞送

BsAbs也是有效載荷遞送的載體。目前放射免疫治療和抗體-藥物偶聯(lián)物等抗體已經(jīng)進(jìn)入臨床。在這種方法中，含有同位素或藥物的有效載荷直接與抗體耦合。⁹⁰Y-ibritumomab tiuxetan注冊(cè)用于治療非霍奇金淋巴瘤,曲妥珠單抗抗體偶聯(lián)物（ado-trastuzumab emtansine）注冊(cè)用于治療轉(zhuǎn)移性乳腺癌HER2 過(guò)表達(dá)的患者，brentuximab vedotin登記治療霍奇金淋巴瘤和系統(tǒng)性的間變性大細(xì)胞淋巴瘤。它們通過(guò)將抗體與TAA結(jié)合，將有效載荷直接遞送到腫瘤細(xì)胞，帶有有效載荷的抗體，與TAA結(jié)合，然后被內(nèi)在化，有效載荷在細(xì)胞內(nèi)釋放并發(fā)揮作用。
使用bsAb可以實(shí)現(xiàn)新的目標(biāo)定位方法。與抗體直接偶聯(lián)不同，與TAA和有效載荷有親和力的bsAb可以在注射前與有效載荷結(jié)合。通過(guò)首先注射對(duì)TAA和有效載荷具有親和力的bsAb，然后注入有效負(fù)載，也可以實(shí)現(xiàn)預(yù)定目標(biāo)的傳遞。用于向腫瘤遞送有效載荷的預(yù)靶向技術(shù)可能潛在地規(guī)避健康組織長(zhǎng)時(shí)間暴露于有效載荷，從而減輕毒性和不良反應(yīng)。連接有效載荷和bsAb是通過(guò)將bsAb的一只手臂指向有效載荷的半抗原來(lái)實(shí)現(xiàn)的。半抗原是一種本身不具有免疫原性的分子，但可以作為抗原并與抗體結(jié)合。
1993年發(fā)表了第一篇報(bào)告使用bsAb遞送有效載荷的臨床試驗(yàn)的論文。目前，有5種bsAbs正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)，其中4種針對(duì)實(shí)體腫瘤。BsAb TF2，有三個(gè)Fab片段，其中兩個(gè)靶向CEA和一個(gè)靶向有效載荷，目前最快推進(jìn)到2期臨床(圖3)。 ?

5.1放射性有效載荷的預(yù)定投放

表達(dá)CEA的髓樣甲狀腺癌患者注射bsAb TF2，靶向CEA和有效載荷。24小時(shí)后，施用有效負(fù)載，即用111銦標(biāo)記的小肽。在施用該小肽后24小時(shí)觀察腫瘤與組織中有效負(fù)載的比率大于1：20，顯示用bsAbs預(yù)靶向的可行性。理論上，由于其體積小，未綁定的有效載荷將被迅速清除，減小了對(duì)非目標(biāo)組織的損傷。
當(dāng)有效載荷為治療性放射金屬時(shí)，半抗原可作為放射金屬的螯合劑。另一種選擇是使用兩個(gè)半抗原創(chuàng)建一個(gè)大的雙價(jià)半抗原，有利于同兩個(gè)腫瘤結(jié)合的bsAbs，這將使腫瘤的結(jié)合更加穩(wěn)定。該系統(tǒng)被稱為親和增強(qiáng)系統(tǒng)，已用于臨床研究(表2)。
對(duì)于用于放射免疫療法的預(yù)靶向遞送釔-90，將CD38和DOTA-釔復(fù)合物具有親和力的bsAb與通過(guò)鏈霉抗生物素蛋白-?生物素鍵結(jié)合放射性金屬的抗體進(jìn)行比較。在異種移植的非霍奇金淋巴瘤或多發(fā)性骨髓瘤小鼠中，bsAb方法顯示出優(yōu)于鏈霉親和素生物素方法的抗腫瘤效果(Green et al.，2018)。也可以通過(guò)連接有效載荷和抗體的替代方法實(shí)現(xiàn)預(yù)靶向。這些包括鏈霉親和素-?生物素，寡核苷酸或click化學(xué)，如四嗪和反式環(huán)辛烯之間的環(huán)加成反應(yīng)。然而，bsAbs方法是迄今為止唯一在臨床中進(jìn)行測(cè)試的方法(表2)。

5.2?其他有效載荷的遞送

bsAbs通過(guò)結(jié)合螯合劑半抗原，在動(dòng)物模型中探索了bsAb（如阿霉素）預(yù)先靶向遞送其他有毒有效載荷。在這些研究中，螯合劑被加載放射性同位素锝-99，以驗(yàn)證目標(biāo)特異性結(jié)合。其他半抗原，如地高辛，也可以結(jié)合到有效載荷上，用于藥物傳遞。幾種有效載荷，如阿霉素和與地高辛結(jié)合的熒光染料Cy5，在人類異種移植小鼠模型中顯示出特定的靶向性。
一種直接靶向的方法，即在給藥前將bsAb和有效載荷孵育的方法正在進(jìn)行臨床實(shí)驗(yàn)。在這種方法中，有效載荷被封裝在一個(gè)細(xì)菌衍生的納米細(xì)胞中，稱為engeneic delivery vehicle (EDV)，bsAbs是通過(guò)Fc區(qū)域連接在一起的兩個(gè)抗體。有效載荷可以是化療藥物，如阿霉素或紫杉醇，但也可以是microRNA。三個(gè)測(cè)試EDVs的試驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)公開，一期臨床數(shù)據(jù)顯示安全狀況尚可接受。
bsAb DT2219與有效載荷直接偶聯(lián)，并且靶向CD22和CD19以增強(qiáng)特定的遞送能力。有效載荷為白喉毒素，經(jīng)CD19和/或CD22內(nèi)化后進(jìn)入胞質(zhì)。該bsAb已在難治性B細(xì)胞惡性腫瘤患者中進(jìn)行研究，25例患者中有1例出現(xiàn)完全反應(yīng)和1例出現(xiàn)部分反應(yīng)(表2)。

6.?信號(hào)阻斷

用聯(lián)合療法靶向癌癥的多個(gè)表位或受體是一種流行的方法，許多抗體治療的聯(lián)合方法正在臨床試驗(yàn)中進(jìn)行評(píng)估。
抗pd -1抗體nivolumab與抗ctla4抗體ipilimumab聯(lián)合治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤已獲FDA和EMA批準(zhǔn)。最近，這種組合也被FDA批準(zhǔn)用于治療晚期腎細(xì)胞癌。另一種稍微不同的聯(lián)合治療是使用帕妥珠單抗和曲妥珠單抗的多表位方法，兩者都以HER2為靶點(diǎn)，但在不同的表位上。它已被批準(zhǔn)作為轉(zhuǎn)移性her2陽(yáng)性腫瘤的聯(lián)合治療。
從理論上講，兩種抗體的靶點(diǎn)可以合并成一個(gè)單一的bsAb，可以產(chǎn)生各種各樣的好處。這種藥物的特異性可以通過(guò)癌癥受體的共同定位來(lái)增強(qiáng)，從而將健康組織的靶向毒性降到最低。此外，可以通過(guò)靶向一個(gè)抗原的不同表位來(lái)提高結(jié)合親和力。這種bsAb的潛在缺點(diǎn)是，它將自己限制在一個(gè)固定的抗原組合，而單抗可以自由組合，可以不同順序給藥或個(gè)性化劑量給藥。根據(jù)ClinicalTrials.gov網(wǎng)站的數(shù)據(jù)，目前正在臨床試驗(yàn)中研究14種bsAbs，它們可以阻斷重要的腫瘤信號(hào)傳導(dǎo)。

6.1腫瘤細(xì)胞表面受體

由于不同信號(hào)之間相互作用，普通bsAbs主要干擾兩個(gè)信號(hào)途徑，如ErbB家族成員EGFR、HER2和HER3。
BsAbs MM-111、JNJ-61186372和MEHD7945A是針對(duì)這些目標(biāo)中的一個(gè)或多個(gè)。盡管它們的半衰期都很長(zhǎng)(表1)，但是它們使用不同的結(jié)構(gòu)來(lái)實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)。
有趣的是，針對(duì)EGFR和HER3的bsAb MEHD7945A比抗EGFR抗體西妥昔單抗或EGFR 激酶抑制劑厄洛替尼更有效，在人非小細(xì)胞肺癌和頭頸部鱗癌的異種移植模型中克服了西妥昔單抗和厄洛替尼耐藥。這很可能是由于阻斷了ErbB家族成員的信號(hào)通路的交互作用。然而，MEHD7945A對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞的2期試驗(yàn)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)MEHD7945A優(yōu)于西妥昔單抗的益處。因此，這個(gè)bsAb的開發(fā)已經(jīng)停止(表2)。
正在研究的其他靶標(biāo)有死亡受體，如CD95，或參與溶酶體內(nèi)化的受體，如CD63。以CD20和cd95為靶點(diǎn)的bsAb比不同的抗CD20抗體變體更能抑制人類異種移植瘤小鼠的腫瘤生長(zhǎng)。為了提高抗體藥物偶聯(lián)物，我們?cè)O(shè)計(jì)了一種載藥bsAb，它除了結(jié)合HER2外，還結(jié)合受體CD63。熒光共聚焦顯微鏡顯示，能夠誘導(dǎo)其內(nèi)化，改善了her2陽(yáng)性異種移植小鼠模型的腫瘤抑制作用。
CD47-SIRPα交互,也稱之為“別吃我信號(hào)”,通過(guò)在巨噬細(xì)胞上表達(dá)的SIRPα抑制表達(dá)CD47的細(xì)胞的吞噬作用和該靶點(diǎn)過(guò)表達(dá)在許多固體和血液腫瘤細(xì)胞上。這種相互作用也可能被bsAbs破壞。在與Raji腫瘤細(xì)胞異種移植的小鼠中，靶向CD20和CD47的IgG-scFv bsAb延長(zhǎng)了小鼠的生存期，靶向CD19和CD47的IgG-like bsAb根除了腫瘤，而抗cd47、抗cd20或抗cd19抗體是無(wú)效的。
靶向SIRPα在用Burkitt淋巴瘤異種移植的小鼠中不誘導(dǎo)腫瘤消退,盡管結(jié)合anti-CD20抗體美羅華導(dǎo)致協(xié)同效應(yīng)和作用于SIRPα和CD70的bsAb減緩腫瘤的生長(zhǎng)。然而,bsAb與抗SIRPα抗體聯(lián)合抗CD70抗體產(chǎn)生的腫瘤生長(zhǎng)減少相同。 ?

6.2免疫受體

隨著免疫檢查點(diǎn)抑制劑的建立及其在腫瘤治療中的結(jié)合，bsAbs正在探索作為這些現(xiàn)有治療的補(bǔ)充或改進(jìn)。四價(jià)雙親和重定向(DART)結(jié)構(gòu)的MGD013以兩價(jià)同時(shí)靶向淋巴細(xì)胞活化基因3 (lag3)和pd -1;它將在晚期實(shí)體瘤患者的臨床試驗(yàn)中得到驗(yàn)證。在體外，MGD013較單一治療或聯(lián)合治療引起T細(xì)胞因子釋放增加，提示T細(xì)胞活化增加。
MEDI5752是一種結(jié)合PD-1和CTLA-4抑制腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的抗體。這將在晚期實(shí)體腫瘤患者的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試。
IgG樣雙抗FS118通過(guò)其Fab片段靶向PD-L1，通過(guò)其Fc區(qū)域靶向lag3，也阻斷了兩條通路。FS118的小鼠抗體，靶向小鼠Lag-3和PD-L1，通過(guò)增加CD8:Tregs比值，劑量依賴性的誘導(dǎo)了其抗腫瘤活性，改變了免疫浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的組成。該結(jié)構(gòu)正在晚期癌癥患者的臨床試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試(表S1)。

6.3抑制血管生成

除了抑制細(xì)胞膜上的靶標(biāo)，腫瘤環(huán)境本身也可以成為靶點(diǎn)。Crossmab雙抗vanucizumab通過(guò)作用于血管生成素-2 (ang2)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子- a (VEGF-A)來(lái)抑制血管生成。bsAb OMP-305B83靶向δ樣配體4和VEGF。在該結(jié)構(gòu)中，兩種bsAb都是帶有Fc的，因?yàn)殚L(zhǎng)的半衰期對(duì)于效的因子消耗是至關(guān)重要的。
Vanucizumab可抑制多種基因的患者來(lái)源的異種移植瘤模型小鼠的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。它還增加了腫瘤內(nèi)免疫細(xì)胞的激活，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞上調(diào)PD-L1的表達(dá)(在多個(gè)同源小鼠模型中已經(jīng)驗(yàn)證)。在該方法中，在vanucizumab中添加抗pd -1抗體治療可提高存活率，為進(jìn)一步合理評(píng)價(jià)該bsAb聯(lián)合免疫治療提供了依據(jù)(表3)。

6.4增加特異性

bsAb RO6874813是一個(gè)2:2的Crossmab，它采用了一種不同的方法。它與腫瘤細(xì)胞上激活TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體之一的死亡受體(DR) 5和腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞上的纖維母細(xì)胞活化蛋白(FAP)具有親和力。與之前用抗體激活腫瘤細(xì)胞上的DR5的嘗試不同，這種bsAb通過(guò)對(duì)癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞的親和力增強(qiáng)了對(duì)腫瘤的特異性。在體外和人移植成纖維細(xì)胞與不同的癌癥或病人來(lái)源的肉瘤組合的小鼠模型中，這種bsAb的有效性取決于與癌癥相關(guān)的成纖維細(xì)胞的存在。在體內(nèi)模型中，bsAb比抗dr5治療更有效地抑制腫瘤生長(zhǎng)。

7.?剩余的挑戰(zhàn)

blinatumomab和emicizumab的批準(zhǔn)刺激了bsAbs進(jìn)入臨床試驗(yàn)(圖4)。在采用小分子量雙抗治療患者時(shí)，需要持續(xù)給藥，如blinatumomab，以保持恒定的血藥濃度。解決這一不足的一種方法是通過(guò)添加Fc區(qū)域延長(zhǎng)bsAbs的半衰期。
目前，兩種流行的小型bsAb平臺(tái)BiTE和DART平臺(tái)，在臨床試驗(yàn)中都有Fc區(qū)域擴(kuò)展版本(圖1C)。針對(duì)DLL3和CD3的AMG757是BITE-Fc;MGD007和MGD009分別靶向糖蛋白A33和CD3、B7-H3和CD3，都是為DART-Fc結(jié)構(gòu)。所有這些bsAbs都針對(duì)實(shí)體腫瘤。MGD007最近完成了復(fù)發(fā)或難治性轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者的一期臨床試驗(yàn)(NCT02248805)，目前研究結(jié)果尚未發(fā)表。然而，MGD007的研究設(shè)計(jì)說(shuō)明了更長(zhǎng)的半衰期的優(yōu)勢(shì);使用每周和三周的治療方案，而靶向CD123和CD3的DART分子MGD006通過(guò)持續(xù)靜脈輸注給AML患者(NCT02152956)。越來(lái)越多進(jìn)入臨床試驗(yàn)的新型bsAbs具有Fc區(qū)域(圖4)。
此外，blinatumomab通過(guò)逐步給藥來(lái)減輕毒性。這種結(jié)構(gòu)的嚴(yán)重毒性是由一種叫做細(xì)胞因子釋放綜合征的全身細(xì)胞因子釋放引起的，常見(jiàn)于T細(xì)胞參與治療中。除了逐步給藥，皮質(zhì)類固醇也用于減少細(xì)胞因子釋放綜合征。

圖4正在開發(fā)中并在ClinicalTrials.gov網(wǎng)站上注冊(cè)針對(duì)癌癥患者開展臨床試驗(yàn) 的BsAbs。線條顯示每年使用的結(jié)構(gòu)數(shù)量，bsAbs顯示為點(diǎn)。他們?cè)趫D表中的位置顯示了所使用的結(jié)構(gòu)和他們第一次臨床試驗(yàn)的開始日期。?

最近，通過(guò)細(xì)胞因子水平檢測(cè)，在人類B細(xì)胞淋巴瘤的小鼠模型中，使用抗CD20抗體預(yù)處理后，給予CD20-和cd3靶向Crossmab bsAb可降低毒性。在該研究設(shè)計(jì)中，預(yù)處理使外周血和繼發(fā)性淋巴器官中的B細(xì)胞減少，從而防止了它們的意外激活，避免了招募免疫細(xì)胞的bsAb釋放細(xì)胞因子。
此外，最近對(duì)同源小鼠腫瘤模型的研究表明，具有不同CD3親和力的her2靶向的bsAbs的分布存在差異。CD3的高親和力降低了全身暴露，并向淋巴組織轉(zhuǎn)移攝取)。另一項(xiàng)研究表明，參與CD3和c型凝集素樣分子-1的bsAb的副作用依賴于CD3的親和力:在食蟹猴實(shí)驗(yàn)中高親和力變異導(dǎo)致細(xì)胞因子釋放水平增高。
這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了對(duì)像bsAbs這樣的新結(jié)構(gòu)進(jìn)行廣泛的藥代動(dòng)力學(xué)研究的必要性，例如通過(guò)分子成像。雙特異性抗體結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)樵撍幬锏纳锓植际怯稍摻Y(jié)構(gòu)的兩個(gè)部分以及該結(jié)構(gòu)的所有其他藥效學(xué)特性決定的。雖然有許多方法來(lái)測(cè)量新藥的藥代動(dòng)力學(xué)，但分子成像是唯一的非侵入性方法。
分子成像研究可用于建立雙特異性結(jié)構(gòu)部分藥代動(dòng)力學(xué)的預(yù)測(cè)模型，并制定最佳的給藥策略。這對(duì)于所有尚未在臨床試驗(yàn)中評(píng)估的不同結(jié)構(gòu)尤其重要。
分子成像用于藥物動(dòng)力學(xué)研究的一個(gè)例子是一種用于正電子發(fā)射斷層掃描的鋯89標(biāo)記的AMG211示蹤劑。AMG211是一種針對(duì)CEA和CD3的BiTE。在對(duì)晚期胃腸道腺癌患者的I期試驗(yàn)中，使用這種方法對(duì)轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行了成像?；颊唧w內(nèi)和患者之間存在異質(zhì)性腫瘤攝取，淋巴組織中存在cd3特異性攝取。 ?

8.?結(jié)論 ?

評(píng)估這些藥物的臨床試驗(yàn)證明，人們對(duì)bsAbs作為治療癌癥的一種方法非常感興趣。bsAb目前用于臨床實(shí)踐，但沒(méi)有一種正在進(jìn)行癌癥治療的三期臨床試驗(yàn)。大多數(shù)被評(píng)估的bsAbs具有相同的作用機(jī)制:免疫細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的結(jié)合。在遞送有效載荷方面，使用bsAbs的熱情似乎由于諸如click化學(xué)等簡(jiǎn)單的共軛方法的出現(xiàn)而有所減弱。
臨床前研究表明，免疫細(xì)胞參與的bsAbs與抗pd1、抗pd - l1等免疫調(diào)節(jié)劑聯(lián)合使用后，其抗腫瘤作用增強(qiáng)。最初的臨床結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)，但還需要更多的數(shù)據(jù)。將進(jìn)入臨床試驗(yàn)的不同而新穎的bsAbs結(jié)構(gòu)也為使用分子成像揭示其體內(nèi)行為提供了強(qiáng)有力的論據(jù)。近年來(lái)，bsAb已成為一種多用途的工具，但除了blinatumomab，它還沒(méi)有導(dǎo)致臨床突破。然而，由于越來(lái)越容易生產(chǎn)以及雙特異性抗體獨(dú)特的作用機(jī)制，bsAbs可能成為一個(gè)有價(jià)值的抗腫瘤軍火庫(kù)的補(bǔ)充。


參考文獻(xiàn)：

A review of bispecific antibodies and antibody constructs in oncology and clinical challenges