“?腫瘤微環(huán)境中靶點(diǎn)蛋白表達(dá)水平，浸潤(rùn)的T細(xì)胞，及其他類(lèi)型的免疫細(xì)胞與免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）的應(yīng)答密切相關(guān)。利用測(cè)序等生物信息學(xué)方法建立模型預(yù)測(cè)ICI的響應(yīng)”?

01

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PD-L1表達(dá)?

預(yù)計(jì)PD-L1的表達(dá)對(duì)Anti-PD-L1或anti-PD1的治療有一定的作用。因此，免疫組織化學(xué)(IHC)檢測(cè)PD-L1蛋白的表達(dá)已被應(yīng)用于臨床。目前，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)PD-L1IHC作為NSCLC患者anti-PD1治療的配套診斷。例如，pbrobrolizumab被批準(zhǔn)用于PD-L1非小細(xì)胞肺癌患者(定義為PD-L1，至少50%的腫瘤細(xì)胞用于一線使用，至少1%用于二線使用)。盡管如此，PD-L1的表達(dá)仍然是免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）反應(yīng)一個(gè)不完全的預(yù)測(cè)因子。對(duì)多種腫瘤類(lèi)型的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達(dá)與ICI反應(yīng)或OS呈正相關(guān)，而其他研究則未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性（如頭頸部腫瘤等）。

PD-L1生物標(biāo)志物研究結(jié)果矛盾的潛在原因包括使用不同的檢測(cè)方法、PD-L1表達(dá)的時(shí)態(tài)和ITH以及評(píng)估陽(yáng)性程度的非標(biāo)準(zhǔn)化標(biāo)準(zhǔn)，例如PD-L1相對(duì)染色強(qiáng)度，和百分比等。此外，即使PD-L1的表達(dá)與反應(yīng)相關(guān)，也有許多低到無(wú)PD-L1表達(dá)的患者經(jīng)歷了持久的臨床受益。因此，PD-L1狀態(tài)可能不是臨床治療決策的一個(gè)足夠全面的獨(dú)立生物標(biāo)記物。重要的是，一項(xiàng)對(duì)聯(lián)合使用anti-CTLA 4和anti-PD1的非小細(xì)胞肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1染色和TMB是獨(dú)立的反應(yīng)預(yù)測(cè)指標(biāo)，包含這兩種因素的多變量模型提高了預(yù)測(cè)的敏感性和特異性。最近，在keynote189三期臨床試驗(yàn)中，有報(bào)道說(shuō)PD-L1水平可能是在NSCLC患者一線治療中對(duì)pembrolizumab單抗加化療的反應(yīng)的預(yù)測(cè)。研究人員觀察到，PD-L1在各級(jí)表達(dá)水平上，對(duì)免疫治療加化療方案的應(yīng)答者的PD-L1表達(dá)增強(qiáng)，但隨著PD-L1閾值的放寬，PD-L1陽(yáng)性表達(dá)的預(yù)測(cè)作用明顯減弱。作為另一個(gè)重要的警告，一些研究發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型也應(yīng)該考慮到。在黑色素瘤和尿路上皮癌患者的獨(dú)立隊(duì)列中，發(fā)現(xiàn)PD1在腫瘤浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞上的表達(dá)，而在腫瘤細(xì)胞本身上不表達(dá)，分別與抗PD1和抗PDL1的反應(yīng)有關(guān)。?

02?

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腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞：密度、表型和多樣性?

人們認(rèn)為，免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）治療，特別是anti-PD1和anti-PD-L1，部分是通過(guò)激活已有的腫瘤免疫應(yīng)答起作用的。因此，ICI反應(yīng)的另一個(gè)潛在預(yù)測(cè)因素是腫瘤內(nèi)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)的密度。事實(shí)上，TIL密度是一些腫瘤類(lèi)型的強(qiáng)陽(yáng)性預(yù)后指標(biāo)，而不考慮ICI治療。例如，一種被稱(chēng)為免疫核心的指標(biāo)，涉及對(duì)腫瘤中心和周?chē)腃D8 T細(xì)胞進(jìn)行量化，是OS的一個(gè)強(qiáng)有力的預(yù)測(cè)因子，可以補(bǔ)充CRC中傳統(tǒng)的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)分期或MSI狀態(tài)。值得注意的是，單細(xì)胞測(cè)序顯示CD4記憶T細(xì)胞也在對(duì)ICI 有反應(yīng)的人類(lèi)黑色素瘤中富集。在抗PD1治療的背景下，據(jù)報(bào)道，IHC在腫瘤侵襲性邊緣測(cè)量的TIL密度與抗-PD1反應(yīng)密切相關(guān)，這種方法可能很有前途，但很難標(biāo)準(zhǔn)化，需要更多的數(shù)據(jù)來(lái)說(shuō)明該方法的通用性。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，影響ICI結(jié)果的不僅僅是TIL的位置和密度，還有TIL的表型。例如，雖然抗PD1治療后，抗CTLA 4的患者TIL濃度沒(méi)有明顯變化，但應(yīng)答與T效應(yīng)細(xì)胞活性指標(biāo)CYT 50(以穿孔素1(PRF 1)和顆粒酶轉(zhuǎn)錄水平54的幾何平均數(shù)計(jì)算)的增加有關(guān)。值得注意的是，不論腫瘤類(lèi)型如何，CYT與tmb都有顯著的相關(guān)性，這支持了這樣的觀點(diǎn)，即癌癥的免疫控制涉及T細(xì)胞介導(dǎo)的對(duì)來(lái)自nssnv的腫瘤新抗原的溶細(xì)胞反應(yīng)。

除了T效應(yīng)細(xì)胞活化表型外，其他T細(xì)胞表型標(biāo)記也與ICI反應(yīng)相關(guān)。例如，TIL表面表達(dá)的PD1水平可能與抗腫瘤免疫反應(yīng)的效果有關(guān)。具體來(lái)說(shuō)，對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者TIL的分析顯示，在PD1表達(dá)的基礎(chǔ)上，有三種不同的CD8 T細(xì)胞。PD1表達(dá)最高的腫瘤群體稱(chēng)為PD1Tumour(PD1T)，因?yàn)镻D1T與慢性病毒感染相關(guān)的PD1hi細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄上明顯不同。在三個(gè)分離的CD8 T細(xì)胞群中，只有PD1T細(xì)胞能夠在體外對(duì)自體腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子反應(yīng)，這表明該細(xì)胞群在腫瘤抗原特異性T細(xì)胞中富集。重要的是，治療前PD1T細(xì)胞水平與抗PD1應(yīng)答呈正相關(guān)；然而，這些結(jié)果仍有待于驗(yàn)證隊(duì)列的驗(yàn)證。相反，在小鼠體內(nèi)的研究表明，由于Treg細(xì)胞相互作用、染色質(zhì)重塑或轉(zhuǎn)錄重組，在慢性抗原暴露下，PD1高表達(dá)的T細(xì)胞可能表現(xiàn)出不可逆轉(zhuǎn)的耗竭表型。此外，一項(xiàng)對(duì)HNSCC患者的研究發(fā)現(xiàn)，高PD1表達(dá)的腫瘤內(nèi)T細(xì)胞百分比與切除后PFS 差直接相關(guān)，但這些患者未接受ICI治療，而HPV狀態(tài)可能是HNSCC的一個(gè)混雜變量。另一項(xiàng)針對(duì)抗PD1治療的非小細(xì)胞肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤和外周血中積累的CD4 FOXP 3?PD1hi T細(xì)胞(4PD1hi)是腫瘤負(fù)荷的一種功能。重要的是，治療時(shí)外周血4PD1hi細(xì)胞計(jì)數(shù)的下降與這個(gè)隊(duì)列中OS的改善顯著相關(guān)。NSCLC相關(guān)的PD1T細(xì)胞的一個(gè)獨(dú)特的特征是它們表達(dá)趨化因子CXCL13，它專(zhuān)門(mén)招募B和T濾泡輔助(TFH)細(xì)胞。CXCL 13-TFH細(xì)胞-B細(xì)胞軸曾被證明與非ICI治療的CRC患者的長(zhǎng)期存活有關(guān)。雖然人們普遍認(rèn)為B細(xì)胞和TFH細(xì)胞不是抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要成分，但這些發(fā)現(xiàn)表明腫瘤微環(huán)境的這一部分可能需要在ICI反應(yīng)的背景下進(jìn)一步研究。

應(yīng)用新的單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)平臺(tái)允許高分辨率的表型特征，這是不可能的批量測(cè)序方法。對(duì)32例經(jīng)ICIS治療的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了非監(jiān)督聚類(lèi)，確定了兩種主要的腫瘤內(nèi)CD8 T細(xì)胞表型：記憶型和疲勞型。記憶樣TILs與疲勞TIL的比值與免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICIS）的反應(yīng)密切相關(guān).此外，還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Tcf 7在具有記憶樣表型的T細(xì)胞中被選擇性表達(dá)。因此，CD8 tcf 7和CD8 tcf 7?TIL的比值與抗-pd 1治療的黑色素瘤患者的應(yīng)答和生存密切相關(guān)，即使在總T細(xì)胞浸潤(rùn)沒(méi)有明顯差異的情況下也是如此。

一種有效的T細(xì)胞反應(yīng)涉及特異性抗原反應(yīng)T細(xì)胞克隆的激活和擴(kuò)增.因此，腫瘤內(nèi)或外周T細(xì)胞庫(kù)的克隆結(jié)構(gòu)可能是與ICI反應(yīng)相關(guān)的腫瘤免疫原性的另一個(gè)指標(biāo)。T細(xì)胞庫(kù)多樣性可以用兩種互補(bǔ)指標(biāo)來(lái)量化：豐富度，即獨(dú)特的TCR序列數(shù)和克隆性，即序列分布的均勻性(低克隆性表示所有克隆的分布相等，高克隆性表示傾斜或寡克隆群體，少數(shù)克隆占主導(dǎo)地位)。腫瘤內(nèi)或外周T細(xì)胞的多樣性與ICI反應(yīng)之間的關(guān)系似乎是復(fù)雜的，因?yàn)橐恍┭芯堪l(fā)現(xiàn)治療前或治療后的克隆性水平與反應(yīng)呈正相關(guān)，而另一些研究表明，只有在治療中增加克隆性與抗-PD1應(yīng)答相關(guān)。另一項(xiàng)針對(duì)30例黑色素瘤患者的研究發(fā)現(xiàn)，TIL多樣性與抗-PD1反應(yīng)或存活無(wú)關(guān)，但沒(méi)有檢測(cè)治療后的變化。有趣的是，一項(xiàng)對(duì)29例經(jīng)抗PDL 1治療的尿路上皮癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，治療前外周T細(xì)胞克隆性與PFS和OS呈負(fù)相關(guān)，而T細(xì)胞內(nèi)克隆性與生存期無(wú)相關(guān)性。同樣，一項(xiàng)對(duì)25例轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，抗CTLA 4治療的患者外周血T細(xì)胞克隆性與生存呈負(fù)相關(guān)，但與抗PD1無(wú)關(guān)。更復(fù)雜的是，先前的免疫治療暴露可能會(huì)影響T細(xì)胞儲(chǔ)備動(dòng)力學(xué)在隨后的抗-PD1的使用。具體來(lái)說(shuō)，在治療中，抗CTLA4治療的黑色素瘤患者體內(nèi)T細(xì)胞豐富度的增加與抗PD1反應(yīng)有關(guān)，而T細(xì)胞克隆性的增加與免疫治療中的抗PD1反應(yīng)有關(guān)。這些結(jié)果表明，需要做更多的工作來(lái)闡明腫瘤內(nèi)和外周T細(xì)胞多樣性作為ICI反應(yīng)指標(biāo)的效用。?

03

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腫瘤微環(huán)境不只有T細(xì)胞?

許多其他類(lèi)型的免疫細(xì)胞可能影響ICI的療效。雖然目前還沒(méi)有通過(guò)FDA批準(zhǔn)的檢測(cè)方法來(lái)預(yù)測(cè)免疫檢查點(diǎn)抑制劑（ICI）的療效，但目前正在做的工作是破譯這些細(xì)胞類(lèi)型對(duì)應(yīng)答率的影響。為了更全面地了解腫瘤的免疫微環(huán)境，從RNA測(cè)序結(jié)果中提取免疫細(xì)胞表型和豐度數(shù)據(jù)的方法已經(jīng)發(fā)展成。這種計(jì)算被應(yīng)用于治療前和治療后黑色素瘤患者的腫瘤樣本，發(fā)現(xiàn)抗-PD1反應(yīng)與CD8 T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的增加和巨噬細(xì)胞的減少有關(guān)。這一補(bǔ)充數(shù)據(jù)提示髓系細(xì)胞在ICI反應(yīng)中具有潛在的抑制作用。在一組獨(dú)立的黑色素瘤患者中，腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMS)與不良的抗PD1反應(yīng)之間存在類(lèi)似的相關(guān)性。

此外，在黑色素瘤患者中，骨髓源性抑制細(xì)胞(MDSCs)的低分化群體的外周血水平與抗CTLA 4反應(yīng)不佳有關(guān)。事實(shí)上，在一項(xiàng)利用機(jī)器學(xué)習(xí)來(lái)識(shí)別所有TCGA腫瘤樣本CYT預(yù)測(cè)參數(shù)的研究中，最關(guān)鍵的特征之一是缺乏MDSC 。該模型的另一個(gè)主要特征是CD8 T細(xì)胞、γδT細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的富集，以及Treg細(xì)胞的耗竭。值得注意的是，免疫表型核心在兩組獨(dú)立的ICI患者中區(qū)分應(yīng)答者和非應(yīng)答者的敏感性和特異性都很高。在一項(xiàng)對(duì)腎癌患者的獨(dú)立研究中，在接受抗-PDL 1的患者中，高的瘤內(nèi)髓樣信號(hào)與PFS中位數(shù)下降近有關(guān)，再次強(qiáng)調(diào)髓系細(xì)胞對(duì)ICI反應(yīng)的抑制作用。值得注意的是，聯(lián)合使用VEGF抑制劑可使髓細(xì)胞含量高的腫瘤患者的中位pfs增加8倍以上，這表明髓系信號(hào)可能是選擇RCC患者聯(lián)合治療的有用的生物標(biāo)記物。

髓系細(xì)胞的特異性亞群可能在調(diào)節(jié)T細(xì)胞排斥中起重要作用。據(jù)報(bào)道，LY6ClowF4/80巨噬細(xì)胞可調(diào)節(jié)T細(xì)胞對(duì)胰腺癌的排斥作用。這些巨噬細(xì)胞位于腫瘤微環(huán)境之外，它們協(xié)調(diào)了獲得性T細(xì)胞免疫特權(quán)的位點(diǎn)，并消除了它們，提高了免疫治療誘導(dǎo)T細(xì)胞依賴性腫瘤殺傷的能力。總之，對(duì)腫瘤微環(huán)境的檢查顯示出作為ICI療效的預(yù)測(cè)生物標(biāo)記物的巨大前景。?

04

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轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳標(biāo)記?

RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析已被用于揭示與ICI反應(yīng)或耐藥性相關(guān)的全球腫瘤和微環(huán)境特征。一項(xiàng)研究確定了治療前的特征，包括28個(gè)黑色素瘤患者組中與抗PD1抵抗相關(guān)的26個(gè)轉(zhuǎn)錄亞信號(hào)。然而，在另外兩個(gè)獨(dú)立的黑色素瘤組中，這一特征與抗CTLA 4或抗PD1反應(yīng)無(wú)關(guān)，這表明它可能反映了分析過(guò)的原始隊(duì)列特有的特征。另一項(xiàng)對(duì)抗PD1治療的黑色素瘤患者的研究發(fā)現(xiàn)，治療前RNA表達(dá)特征與腫瘤克隆結(jié)構(gòu)的治療改變有關(guān)。據(jù)推測(cè)，由于腫瘤克隆結(jié)構(gòu)的改變與反應(yīng)和OS有關(guān)，治療前的RNA信號(hào)也可能是治療結(jié)果的預(yù)測(cè)。事實(shí)上，這一RNA特征與改善兩個(gè)獨(dú)立黑色素瘤組的存活率有關(guān)，其中一個(gè)只使用抗PD1，另一個(gè)用抗CTLA 4或抗PD1治療。

初步數(shù)據(jù)表明，這種炎癥基因特征在預(yù)測(cè)腫瘤類(lèi)型中具有預(yù)測(cè)價(jià)值。最近的工作已經(jīng)利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析精細(xì)的細(xì)胞分辨率來(lái)確定與T細(xì)胞排斥相關(guān)的腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄程序。這一特征是預(yù)測(cè)不良的ICI反應(yīng)和降低生存率在多個(gè)獨(dú)立的黑色素瘤患者隊(duì)列。值得注意的是，體外實(shí)驗(yàn)表明CDK 4和CDK 6抑制可以逆轉(zhuǎn)這種T細(xì)胞排斥方案，從而為表達(dá)這一轉(zhuǎn)錄程序的腫瘤患者提供了一種潛在的聯(lián)合策略。

除了基因組和轉(zhuǎn)錄特征外，表觀遺傳改變也可能與對(duì)ICIS的反應(yīng)有關(guān)。利用DNA甲基化微陣列，與ICI反應(yīng)相關(guān)的表觀遺傳標(biāo)記在NSCLC患者的獨(dú)立隊(duì)列中被識(shí)別和驗(yàn)證。此外，單個(gè)基因FOXP3的甲基化狀態(tài)也可以預(yù)測(cè)ICI的應(yīng)答。

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