治療性單克隆抗體已經(jīng)成為目前最有效的生物治療劑之一，大多數(shù)批準的單克隆抗體療法屬于人IgG1亞類，其可以參與免疫系統(tǒng)的體液免疫和細胞免疫。體液免疫的參與主要取決于補體與C1q的相互作用啟動的一系列蛋白水解級聯(lián)反應，細胞免疫應答主要是由于抗體Fc與Fcγ受體（FcγRs）之間的相互作用產(chǎn)生（圖1）。單克隆抗體的療法的成功基于其安全性、選擇性、多樣性、溶解性、耐受性和穩(wěn)定性和長循環(huán)半衰期。盡管許多基于抗體的療法已經(jīng)在臨床和商業(yè)上取得了成功，但基于抗體的療法通常僅在一部分患者中有效，因此，為了在更大的患者群體中實現(xiàn)功效，研究人員已經(jīng)進行了相當大的努力來微調抗體的性質。其中一個重點領域是通過Fc工程調節(jié)抗體與免疫系統(tǒng)的體液和細胞組分相互作用的能力。在這里，我們簡單介紹下通過抗體Fc工程來提高同種型IgG的功效和安全性。

??圖1. 人類細胞亞群中Fc-FcγR相互作用親和力和FcγR表達 ?

Enhance CDC

幾種已批準的抗體已經(jīng)證明具有有效的體外CDC活性，例如抗CD20單克隆抗體rituximab（利妥昔單抗）和atumumab。研究人員利用Fc工程來增強補體的效應功能的方法有很多種（圖2）。 Idusogie等證明K326W/E333S相對于IgG1增強了C1q結合和CDC活性，猜測這兩個殘基在C1q和IgG之間的相互作用中起結構作用。Moore等人證明Fc突變S267E/H268F/S324T比IgG1增強C1q結合47倍和CDC活性6.9倍。推測S267E突變體改變了Fc的電荷，可能增加與C1q亞基B的離子間相互作用。在四種人IgG亞類中，IgG3具有最有效的CDC活性，然而，由于IgG3的相對較短的半衰期以及與IgG3的長鉸鏈區(qū)相關的生物加工問題，目前還沒有批準的IgG3治療劑。為了克服與IgG3的相關問題，Natsume等人設計了交叉IgG亞類變體，其將IgG1的CH1和鉸鏈區(qū)與IgG3的CH2和CH3區(qū)組合，使其相對于IgG1高達50倍的CDC活性。這種增強的活性可歸因于CH2區(qū)域中IgG1和IgG3之間的差異（即K274Q/N276K/Y300F），其在結構上接近被認為是C1q相互作用的關鍵氨基酸D270/K322/P329/P331的位置處。 Diebolder等采用突變E345R/E430G/S440Y改造Fc區(qū)，產(chǎn)生預先形成的IgG六聚體和增強的CDC活性。結構數(shù)據(jù)表明，六聚體將K322定位在能夠有利地與六聚體C1q頭部相互作用的位置。

圖2. Enhance CDC 總結

FcγR-based 工程化增強效應功能

mAb的功效部分依賴于募集基于FcγR的效應子功能。這包括通過FcγRIIIa激活NK細胞和由此產(chǎn)生的ADCC和炎性細胞因子釋放，巨噬細胞介導的ADCP，以及其他免疫細胞（例如嗜中性粒細胞）的募集和活化。對于NK細胞介導的ADCC的關鍵受體FcγRIIIa，存在兩種多態(tài)性變體：對IgG1具有較高親和力的V158和對IgG1具有較低親和力的F158。在一些臨床試驗中報道了這些多態(tài)性的潛在重要性，其中具有高親和力V158多態(tài)性的癌癥患者與具有低親和力F158多態(tài)性的患者相比，顯示出來自西妥昔單抗，曲妥珠單抗和利妥昔單抗更好的治療效果。由于增強與FcγR的結合和由此產(chǎn)生的增強的先天免疫細胞功能的潛在益處，研究人員已經(jīng)利用多種方法來設計mAb，包括糖工程和Fc區(qū)內(nèi)的氨基酸突變。

a）Glyco-engineering

IgG在CH2結構域的氨基酸N297處含有保守的糖基化位點，聚糖的核心結構由N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）和甘露糖組成，其中另外的修飾可包括二等分GlcNAc，巖藻糖，半乳糖和唾液酸。 Umana等證明，在表達b(1,4)-N-乙酰葡糖胺基轉移酶III的中國倉鼠卵巢（CHO）細胞系中產(chǎn)生的IgG1抗體相對于IgG1具有增強的ADCC活性。 Shields等人的一項研究表明巖藻糖缺乏的IgG1相對于IgG1具有高達50倍的FcγRIIIa結合增強以及ADCC增強活性。目前，已經(jīng)批準了糖工程化抗體，如抗CD20 mAb-obinutuzumab和抗CCR4 mAb-mogamulizumab，證明用于增強效應功能的糖工程可以轉化為臨床批準的治療劑。

b）氨基酸突變

研究人員通過了IgG Fc區(qū)的氨基酸突變來調節(jié)與FcγR的效應子功能。包括點突變、設計算法、酵母展示和不對稱工程等方法（圖3）。

圖3. FcγR-based 工程化增強效應功能總結

Shields等對人IgG1的CH2和CH3結構域中所有溶劑暴露的氨基酸進行單個丙氨酸點突變。證明組合幾種鑒定的突變（例如，S298A/E333A/K334A）導致相對于IgG1增強的ADCC。Lazar等人使用通過設計算法和高通量篩選，設計了一系列Fcγ受體高親和力的Fc變體。S239D/I332E和S239D/I332E/A330L被鑒定為具有增強的ADCC活性的兩種變體。解析S239D/A330L/I332E的Fc突變片段的晶體結構，表明額外的氫鍵，疏水接觸和靜電相互作用是導致與FcγRIIIa結合增強主要原因。Richards證明，在S239D/I332E突變中加入G236A突變可使FcγRIIa的結合提高70倍，F(xiàn)cγRIIa/FcγRIIb結合率（活化/抑制率）提高13倍，并增強抗體介導的吞噬作用（ADCP）。Stavenhagen等利用酵母表面展示鑒定突變體F243L/R292P/Y300L/V305I/P396L，其顯示ADCC活性增加>100倍。具有這5種突變的抗HER2 mAb-margetuximab完成了HER2陽性晚期乳腺癌患者的III期臨床試驗，作為三線、四線藥物比赫賽汀本身顯著延長PFS、降低24%進展風險。Mimoto等人通過在每個Fc結構域中引入不同的氨基酸變化，設計具有不對稱工程Fc結構域的抗體變體。他們篩選了約1000種變體，證明在一條重鏈L234Y/L235Q/G236W/S239M/H268D/D270E/S298A突變，在另一條重鏈進行D270E/K326D/A330M/K334E突變可以增加在FcγRIIIaF158的的親和力超過2000倍，在 FcγRIIIaV158親和力超過1000倍。

FcγR-based 工程化降低或消除效應功能

對于mAb與細胞表面受體結合并阻止受體-配體相互作用（即拮抗劑）的情況，可能需要降低或消除效應功能，例如通過減少這種非預期的效應功能以防止靶細胞死亡或不需要的細胞因子分泌。研究人員設計生成了人IgG4變體L235E或F234A/L235A，以及人IgG1變體L234A/L235A等，所有這些都證明減少了炎性細胞因子的釋放。另一種旨在降低效應功能的早期方法是突變糖基化位點，例如N297A、N297Q和N297G。已經(jīng)證明這種糖基化方法成功地消除了Fc了與FcγR的相互作用和效應功能（CDC和ADCC）。

在四種IgG亞類中，每種具有引發(fā)免疫效應功能的不同能力。例如IgG1和IgG3比IgG2和IgG4更有效地募集補體，另外，IgG2和IgG4具有非常有限的ADCC的能力。因此，一些研究者采用跨亞型的方法來減少效應功能（圖4）。批準的抗C5治療劑eculizumab具有118-260的IgG2氨基酸和264-447的IgG4氨基酸，并且已顯示具有有限或不可檢測的效應功能，因此，eculizumab代表了第一個概念驗證。在跨亞型方法的進一步改進中，An等人改造了具有來自IgG4的點突變的IgG2變體（即，H268Q/V309L/A330S/P331S），該變體具有減弱的效應功能以及在恒河猴中與IgG1相當?shù)陌胨テ?，在類似的方法中，Vafa報道了一種變體，其含有IgG2至IgG4的跨亞類突變V309L/A330S/P331S與非種系突變V234A/G237A/P238S/H268A，導致檢測不到CDC，ADCC和ADCP作用。

圖4. FcγR-based 工程化降低或消除效應功能總結

FcRn 工程化調節(jié)mAb半衰期

新生兒Fc受體（FcRn）是一種MH1Like異二聚體，在細胞運輸和IgG的血清半衰期中發(fā)揮核心作用，抗體的長循環(huán)半衰期（7-21天取決于IgG亞類）在很大程度上歸因于它們與FcRn結合的能力。

FcRn主要在核內(nèi)體中表達，它能夠通過胞飲作用內(nèi)化IgG。IgG的CH2-CH3結構域中保守的組氨酸殘基在酸性內(nèi)體pH（6.0-6.5）下質子化，驅動pH依賴性結合FcRn的α-鏈，隨后在生理pH（7.4）下將IgG再循環(huán)并釋放到血液中，從而避免在溶酶體降解。Fc區(qū)與FcRn上的關鍵接觸位置包括L251、M252Y（Fc突變之一）、I253、L309、H310、L314、Q311和N434，研究證實H310的強氫鍵是pH依賴性結合的關鍵，該氨基酸突變?yōu)槿魏纹渌被幔ú话ò腚装彼幔﹦t在pH6.0下不能檢測到與FcRn的結合。FcRn介導的抗體再循環(huán)機制引起了治療性抗體的藥代動力學（PK）的興趣。目前研究人員已經(jīng)在CH2-CH3處設計了突變，目的是延長抗體的血清半衰期進而可以通過降低治療劑量和給藥頻率以降低成本而使患者受益（圖5）。噬菌體展示Fc變體文庫的篩選鑒定了在pH6.0下具有增強的與人FcRn的結合的突變體YTE（M252Y/S254T/T256E）。YTE變體與人和食蟹猴FcRn的結合能力增加了10倍，在食蟹猴PK研究中半衰期增加了4倍。Zalesky等人表明突變M428L/N434S在pH6.0下對人FcRn的親和力增加11倍。當用含有M428L/N434S突變的抗VEGF抗體處理人FcRn轉基因荷瘤小鼠時，與IgG1處理的動物相比，觀察到更好的抗腫瘤效果。這是FcRn依賴性半衰期增加導致的改善的抗腫瘤活性的第一個體內(nèi)證明。Motavizumab-YTE是一種靶向呼吸道合胞病毒的人源化抗體，是第一種針對FcRn介導的半衰期延長而設計的抗體，已在人類受試者中進行測試，I期臨床試驗結果顯示，相對于motavizumab IgG1，其半衰期增加2至4倍。

圖5. FcRn 工程化增加mAb半衰期總結?

參考文獻

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